应用表达谱芯片技术筛选NS5ATP9反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP9基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP9,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NSSATP9转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP9后,有16条差异基因表达水平发生显著改变,其中3条基因表达增强,13条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化、凋亡及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒NS5ATP9作用HepG2细胞后差异表达基因,为阐明NS5ATP9的作用提供了新的依据.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因 ,研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 ,以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(-) -NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 (EST)序列数据库的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP9,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 70。结果 NS5ATP9基因的编码序列全长为 3 3 6个核苷酸 (nt) ,编码产物由 111个氨基酸残基 (aa)组成 ,并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆 。

应用表达谱芯片技术研究NS5ATP13的反式调节基因

目的:应用基因表达谱芯片研究HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP13的反式调节基因. 方法:构建NS5ATP13基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)- NS5ATP13,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)- NS5ATP13转染的人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS5ATP13后,有86条差异基因表达,其中46条基因表达增强,40条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导、代谢、凋亡密切相关. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP13的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP13的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1的反式调节基因筛选

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照组,从中分别提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果:成功构建NS5ATP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后将阳性克隆经菌落PCR分析,得到90个200～1000bp的插入片断。挑选含插入片段的30个克隆进行测序,通过生物信息学分析得到3种已知序列的基因(Ras癌基因家族成员RAN、DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ多肽C、核糖体蛋白L2)和1个未知功能的序列(推测为新基因)。结论:筛选得到的cDNA基因全长序列包括一些与细胞基因表达及恶性转化相关的蛋白质编码基因,为HCVNS5A可能存在的调控机制提供新的线索。

应用表达谱芯片技术对NS5ATP7反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白7(humangene7transactivatedbynonstructuralprotein5AofhepatitisCvirus,HCVNS5ATP7)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP7基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP7,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP7转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP7后,有12条差异基因表达,其中4条基因表达增强,8条基因表达降低.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP7的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP7的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP2 (615)蛋白反式调节基因

目的 :对新基因NS5ATP2 (615 )转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析 ,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法 :应用生物信息学 (bioinformatics)技术 ,分析我们研究组通过抑制消减杂交(SSH)技术筛选得到的新基因NS5ATP2 (615 )的全长编码序列 ,构建NS5ATP2的真核表达载体 pcDNA3 1(-) NS5ATP2 (615 )。应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3 1(-) NS5ATP2 (615 )和 pcDNA3 1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测。 结果 :确定基因NS5ATP2 (615 )由 615nt组成 ,编码 2 0 4aa的蛋白。基因表达谱芯片所检测的 115 2条目的基因均为GenBank中登录的基因 ,NS5ATP2 (615 )表达质粒转染的细胞有 40条差异表达基因 ,其中 18条基因表达增强 ,2 2条基因表达降低。这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关。结论 :基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料。本实验结果为进一步阐明NS5ATP2 (615 )生物学功能及HCVNS5A的致病机制提供了理论依据。

基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP11反式调节基因

目的:应用基因芯片技术研究未知功能基因NS5ATP11的表达对于肝细胞基因表达谱的影响. 方法:从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RT- PCR)扩增出NS5ATP11编码区DNA,常规分子生物学技术构建NS5ATP11的真核表达载体pcDNA3.1(-)- NS5ATP11,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞, NS5ATP11的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA,逆转录为cDNA, 并进行基因芯片技术分析. 结果:证实构建pcDNA3.1(-)-NS5ATP11在HepG2细胞中表达正确.NS5ATP11重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达改变进行分析.结果表明,8种基因的表达水平上调,10种基因的表达水平下调. 结论:NS5ATP11对于肝细胞基因表达谱存在一定影响;基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径,有助于了解NS5ATP11对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.

基因表达谱芯片技术筛选NS5A-TP4蛋白反式调节基因

目的:对新基因NS5A-TP4转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析我室通过抑制性消减杂交技术筛选得到的新基因NS5A-TP4的全长编码序列,并NS5A-TP4构建基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A-YP4.应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.结果:确定基因NS5A-TP4由762nt组成,编码253aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS5A-TP4表达质粒转染的细胞有18条差异表达基因,其中12条基因表达增强,6条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、生长调节密切相关.结论:基因表达谱芯片技术可为初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS5A-TP4生物学功能及HCV-NS5A的致病机制提供了理论依据.

丙型肝炎病毒NS5A蛋白反式调节基因2不同剪切体调节靶基因的比较

目的:利用基因表达谱芯片技术筛选、比较丙型肝炎病毒NS5A反式调节基因2不同剪切体对HepG2细胞基因表达的调控作用及差异性.方法:利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合,克隆人NS5ATP2的不同剪切体蛋白的编码基因,常规分子生物学技术构建相应的真核细胞表达载体pcDNA3.1-NS5ATP2(615)和pcDNA3.1-NS5ATP2(216).脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2利用基因表达谱芯片技术筛选转染细胞的差异表达cDNA的类型.结果:对于2个基因剪切体转染细胞系差异表达基因谱的分析,NS5ATP2(615)和NSSATP2(216)共同上调的基因43条;NS5ATP2(615)和NSSATP2(216)共同下调的基因13条;NS5ATP2(615)上调,而NS5ATP2(216)下调的基因类型3条;未发现NS5ATP2(615)下调;NS5ATP2(216)上调的基因类型;还有一些靶基因,或只受到NS5ATP2(615)的调节,或只受到NS5ATP2(216)的调节.结论:不同剪切体的作用之间有共同的靶基因,也有不同的靶基因,甚至对于同一基因有相反的调节功能.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP5的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以 HCV NS5A 表达质粒 pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与 GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的 Kozak 规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从 HepG2细胞提取总 RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为1191个核苷酸(nt),编码产物由396个氨基酸残基(aa)组成.命名为NS5ATP5,在 GenBank 中注册,注册号为 AF529366.结论:HCV NS5A 反式激活新型靶基因 NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究 HCV NS5A 反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP7的克隆

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因. 方法:以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明, 其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源陛,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP7,在GenBank中注册,注册号为AF529368. 结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为894个核苷酸(nt), 编码产物由297个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP2(615)反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交技术构建人类新基因NS5ATP2 (615)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5KTP2反式激活相关基因,了解该基因的可能生物学功能. 方法:构建NS5ATP2表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ATP2-TP2 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2 细胞为对照:提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA. 半定量RT-PCR显示实验组NS5ATP2的转录水平明显高于对照组.cDNA经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pEGM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人类新基因NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到76个白色克隆,进行茵落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的32个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知功能基因序列,和2个未知功能基因. 结论:应用SSH技术成功构建了NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明NS5ATP2 生物学功能提供理论依据.

抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP13蛋白的上调基因

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)NS5ATP13蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5ATP13蛋白反式激活靶基因。方法 以HCVNS5ATP13表达质粒pcDNA3 .1(-) NS5ATPl3转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并合成cDNA ,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HCVNS5ATPl3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 10 2个白色克隆 ,进行菌落PCR分析 ,其中 96个均得到 10 0～ 10 0 0bp插入片段。挑取 40个插入片段测序分析 ,其中 2个cDNA片段为未知序列 ,通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录 ,另有 3 4个为已知功能序列。结论 成功筛选出 2个新的cDNA序列 ,并获得其全长序列 。

应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP5的上调基因

目的 通过抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)NS5A反式激活蛋白 5 (NS5ATP5 )的反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库 ,筛选HCVNS5ATP5蛋白反式激活靶基因。方法 以HCVNS5ATP5表达质粒pcDNA3 .1(-) NS5ATP5转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并合成cDNA ,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HCVNS5ATP5蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 91个白色克隆 ,进行菌落PCR分析 ,其中 86个均得到 10 0～ 10 0 0bp插入片段。挑取 3 2个插入片段测序分析。其中包括结缔组织生长因子、纤维连接蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白l等重要的基因。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式调节蛋白9的研究进展

HCV NS5A反式调节蛋白9(NS5ATP9),是一种增殖细胞核抗原结合因子,在生物体内参与多种功能,如细胞增殖、分化、凋亡及DNA复制、损伤修复和信号转导等,在肿瘤的发生发展中也起着一定作用。本文将对NS5ATP9的前期研究进行总结,以利于后期对其作用机制和其他功能进行深入探究。