应用酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库与NS5ATP1结合蛋白基因

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出NS5ATP1基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X- α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落10个,其中2个人HLA-B27;2个人亚砷酸盐转移子(arsA);1个人单倍型E22i线粒体;1个人pyrin (MEFV);1个人肌动蛋白素1(cofilin 1);1个人染色体15; 1个来自RP11-353N14克隆人的DNA基因,位于染色体17;1个新基因. 结论:成功克隆出NS5ATP1的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因NS5ATP13的克隆化研究

目的 应用微矩阵 (microarray)技术 ,结合生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式激活基因 ,阐明慢性HCV感染、肝纤维化及肝细胞癌 (HCC)的等相关疾病的发病机制。方法 根据HCV H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV H株cDNA的pBRTM 3 0 11质粒DNA作为模板 ,进行多聚酶链反应 (PCR)扩增 ,获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 1(-) NS5A。以pcD NA3 1(-) NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总RNA ,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3 1(-) NS5A ,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3 1(-) NS5A转染HepG2后提取总RNA ,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因 ,命名为NS5ATP13 ,在GenBank中登录 ,登录号为D2 12 62。NS5ATP13基因的编码序列全长为 2 10 3个核苷酸 (nt) ,编码产物由 70 0个氨基酸残基 (aa)组成。结论 丙型肝炎病毒NS5A基因产物具有显著的反?