抑制和激活Wnt信号通路对甾醇类新药NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化的影响

目的:探讨抑制和激活Wnt信号通路在甾醇类新药NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化中的作用和可能机制。方法:用5、10和20μmol/L的Wnt信号通路抑制剂XAV-939作用于HL-60细胞3 d,用10、20和30mmol/L的Wnt信号通路激活剂Li Cl作用于HL-60细胞1 d,应用RT-RCR和Western blot检测Wnt信号通路的下游靶点基因和蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD14的表达和细胞早期凋亡,筛选最佳抑制浓度和激活浓度。然后用10μmol/L NSC67657分别对已经抑制及激活了的Wnt通路的HL-60细胞作用3 d。分析比较空白对照组、NSC67657单独处理组和激活/抑制剂作用后NSC67657处理组的细胞表面抗原CD14和Wnt下游靶点蛋白的表达水平。结果:20μmol/L XAV-939和20 mmol/L Li Cl能分别有效抑制和激活HL-60细胞Wnt信号通路,分别显著下调和上调cyclin D1,TCF1,c-Jun基因(P<0.05)和蛋白(P<0.05)的表达,且在该条件下CD14^+HL-60细胞不超过1%,没有早期凋亡发生;NSC67657单独作用HL-60细胞能下调Wnt通路下游靶点cyclin D1、TCF1和c-Jun的蛋白表达(P<0.05),CD14^+细胞占(62.13±9.44)%;NSC67657作用于经XAV-939预处理的细胞,可使CD14^+细胞达到(84.17±5.39)%,cyclin D1,TCF1和c-Jun蛋白表达比单独NSC67657处理组降低更显著(P<0.01);而NSC67657作用经Li Cl预处理的细胞,可使CD14^+细胞减少至(33.99±8.37)%,cyclin D1,TCF1和c-Jun蛋白表达较非处理组下降明显较低(P<0.05),但高于单独使用NSC67657处理组(P<0.05)。结论:20μmol/L XAV-939和20 mmol/L Li Cl作为HL-60细胞Wnt信号通路的有效抑制剂和激活剂能够分别显著下调和上调Wnt下游通路靶点基因和蛋白表达,其干预后对NSC67657诱导细胞分化的影响提示Wnt信号通路可能在NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化中起到关键作用。

甾醇类新药NSC67657诱导的HL60细胞单核系分化中β-catenin/ICAT蛋白差异表达及相互作用研究

目的分析甾醇类新药NSC67657诱导HL60细胞单核系分化中,β-catenin/ICAT蛋白的差异表达及相互作用,探讨NSC67657诱导细胞分化的作用机制。方法应用10μmol·L^(-1)NSC67657诱导HL60细胞分化,采用细胞化学染色和流式细胞技术评估细胞的分化方向和分化程度;通过RT-PCR和Western blot方法验证药物作用细胞前后β-catenin和ICAT基因和蛋白的表达差异;采用免疫共沉淀技术分析β-catenin与ICAT蛋白的相互作用情况;采用激光共聚焦技术协同分析目的蛋白的差异表达及细胞内定位。结果NSC67657可诱导HL60细胞向单核系分化。在10μmol·L^(-1)NSC67657作用5d后,CD14的表达可达到90%以上,细胞化学染色支持细胞单核系分化结论。分化后ICAT基因和蛋白表达明显升高(P<0.01),而β-catenin基因和蛋白表达明显下降(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示,ICAT与β-catenin蛋白在细胞分化前后都存在相互作用,药物诱导细胞分化后两者蛋白相互作用条带吸光度明显增加。激光共聚焦结果显示,ICAT蛋白和β-catenin蛋白在胞质和胞核均有荧光,药物诱导HL60细胞分化后,ICAT蛋白胞质和胞核荧光均明显增加,β-catenin蛋白在核内荧光明显减弱,但胞质荧光强度增加,有蛋白胞质转位现象。结论 NSC67657能够诱导HL60细胞向单核系分化,且引起ICAT蛋白和β-catenin蛋白的表达差异;ICAT蛋白与β-catenin蛋白的相互作用增强及β-catenin蛋白从胞核向胞质的转位现象,提示NSC67657可能通过下调并阻止β-catenin蛋白入核,从而导致HL60细胞单核系分化。

甾醇类药NSC67657诱导急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞单核系分化中Wnt信号通路相关蛋白的表达

目的：探讨甾醇类药NSC67657诱导急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞单核系分化时β连环蛋白（β-catenin）和T细胞因子4（ TCF-4）抑制蛋白（ ICAT）和Wnt信号通路相关mRNA和蛋白的表达。方法10μmol／L NSC67657药物处理HL-60细胞5 d后，采用瑞氏染色、非特异酯酶染色分析细胞的分化方向，采用流式细胞术分析细胞的分化程度和细胞周期的分布情况，采用逆转录聚合酶链反应和Western blot检测 Wnt 信号通路相关因子 ICAT、β-catenin、TCF-4、Wnt 信号通路下游靶点c-myc、细胞周期蛋白D1（ cyclin D1）、TCF-1 mRNA和蛋白在细胞分化前后的表达情况。结果 NSC67657可诱导HL-60细胞向单核系分化。10μmol／L NSC67657作用5 d后，处理组CD14＋细胞数为（94．37±2．84）％，高于未处理组[（1．31±0．09）％]，差异有统计学意义（P＜0．01）。处理组G1／G0期细胞所占比例为（76．46±2．83）％，高于未处理组[（59．40±5．42）％]，差异有统计学意义（P＜0．05）；处理组S期细胞所占比例为（18．76±0．98）％，低于未处理组[（34．38±2．61）％]，差异有统计学意义（P＜0．05）。药物作用后HL-60细胞中ICAT mRNA和蛋白的表达水平上调（均P＜0．01），β-catenin mRNA和蛋白的表达水平下调（均P＜0．01），细胞核中β-catenin蛋白的表达水平下调（ P＜0．01）。处理组和未处理组HL-60细胞中TCF-4 mRNA、总蛋白和细胞核蛋白的表达水平差异均无统计学意义（均P＞0．05）。药物诱导HL-60细胞分化后，Wnt信号通路下游靶基因c-myc、cyclin D1、TCF-1 mRNA和蛋白的表达水平均下调（均P＜0．05）。结论 NSC67657可诱导HL-60细胞向单核系分化，导致Wnt信号通路关键调节因子β-catenin及下游靶点的表达下调，Wnt信号通路可能直接或间接地参与了HL-60细胞的单核系分化进程。

CCAAT增强子结合蛋白α在甾醇类新药NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化中的作用

目的探讨CCAAT增强子结合蛋白α（C／EBPα）在甾醇类新药NSC67657诱导HE60细胞向单核系分化中的作用。方法采用NSC67657诱导HL60细胞分化，流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD14的表达。应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot方法连续检测C／EBPα基因和蛋白在细胞分化前后的表达情况。构建pDsRed—C／EBPα真核表达载体，基因测序后采用电转染技术，将真核表达载体转入HL60细胞中，并进行表达验证。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、瑞氏染色和流式细胞技术，观察转染细胞在NSC67657作用前后的增殖和分化情况。结果10μmol／L NSC67657可以诱导HL60细胞向单核系分化，连续诱导5d后，有93．9％的细胞有CD14阳性表达。分化后的HL60细胞中，C／EBPα基因和蛋白表达均先升高后下降，分别在第2天和第3天达到峰值。真核表达载体构建成功，通过电转染和G418筛选，可获得90％以上阳性克隆。C／EBPα高表达可使HE60细胞增殖明显减缓，表面抗原CD11b的表达可达到（50．44±4．92）％。在NSC67657处理的重组质粒转染HL60细胞中，细胞单核系分化受到抑制，保留部分粒系分化。结论NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化不一定通过C／EBPα蛋白的协调作用，但C／EBPα蛋白高表达可以阻止NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化的进程。

Expression of ICAT and Wnt signaling-related proteins in the monocytic differentiation of HL-60 cells induced by a new steroidal drug NSC67657

Objective To investigate the expression of mRNA and proteins ofβ-catenin,TCF-4(ICAT)and Wnt signaling pathway-related genes in the monocytic differentiation of acute myeloid leukemia HL-60 cells induced by a new steroidal drug NSC67657.Methods Wright’s staining andα-NBE staining were used to observe the differentiation of HL-60 cells after 5 days of

NME3蛋白在急性髓系白血病细胞株HL-60和患者骨髓表达趋势研究

为了验证HL-60细胞向粒、单两系分化前后非转移细胞蛋白3(NME3)的表达差异,并探讨该蛋白对急性髓系白血病的诊断价值,采用全反式维甲酸(ATRA)和甾体类新药NSC67657分别诱导急性髓系白血病HL-60细胞向粒系和单核系分化,通过细胞化学染色判断细胞分化方向,通过细胞表面分化抗原(CD11b/CD14)检测判断细胞分化程度,通过磷脂酰丝氨酸外翻排除细胞凋亡,建立细胞分化模型,应用RT-PCR和Western blot方法验证NME3基因和蛋白在细胞分化前后的差异表达情况。收集26例临床确诊的各种类型髓系白血病患者及5例正常人骨髓样本,比较分析NME3蛋白在不同样本组中的表达趋势。结果表明:ATRA(2μmol/L,5 d)和NSC67657(10μmol/L,5 d)可分别诱导HL-60细胞向粒系和单核系分化,其分化程度达到90%以上且不伴随凋亡发生,NME3基因与蛋白表达在细胞两系分化后明显下降。对患者骨髓有核细胞分析发现,NME3蛋白在急性髓系白血病患者骨髓样本中表达较慢性髓系白血病患者组及正常对照组明显升高。结论:NME3蛋白在HL-60细胞分化后表达下调,与其在患者样本中的表达趋势相符,提示该蛋白可能作为急性髓系白血病潜在的分子标志物。