新型冠状病毒Nsp1基因真核表达载体的构建及对宿主蛋白质翻译的影响

非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成功构建SARS-CoV-2Nsp1基因的真核表达载体,并验证其抑制宿主及外源蛋白质翻译的功能。通过PCR技术扩增SARS-CoV-2Nsp1基因后,利用同源重组技术将其连接至pEGFP-N1载体上。经双酶切和测序结果鉴定,SARS-CoV-2Nsp1基因成功克隆至pEGFP-N1载体上。将重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1转染至HEK-293T细胞和HeLa细胞中,经嘌呤霉素标记后,利用Western Blot和考马斯亮蓝染色检测重组质粒的表达以及嘌呤霉素信号。结果表明,重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1在HEK-293T细胞和HeLa细胞中成功表达,并验证其抑制宿主蛋白质和外源转入细胞蛋白质的翻译,为更深入研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的功能奠定基础。

利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒

目的利用反向遗传技术产生NSP1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。方法本研究将轮状病毒SA11株的NSP1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因,采用已建立的“12质粒”轮状病毒反向遗传系统拯救NSP1基因插入和表达EGFP的重组SA11轮状病毒。通过观察细胞病变效应和插入基因(EGFP)的荧光表达初步确定重组病毒的成功拯救,再结合电镜的形态学观察、RT-PCR的测序结果及病毒基因组的检测结果,进一步证明重组轮状病毒的成功拯救和传代扩增。利用TCID 50法和qRT-PCR法,测定了rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的病毒滴度并绘制了基因组复制动力曲线。结果基于“12质粒系统”成功拯救了重组轮状病毒rSA11/NSP1-EGFP,证明NSP1片段截短并插入外源基因后病毒仍可正常复制,且具有良好的遗传稳定性,但病毒滴度低于其亲本株。结论基于NSP1基因插入和表达EGFP的重组轮状病毒能够实现稳定遗传,为利用反向遗传学构建表达外源基因的轮状病毒载体的深入探索提供了基础。

盖塔病毒非结构蛋白NSP1多克隆抗体的制备及鉴定

试验旨在获得能够特异性识别盖塔病毒(Getah virus, GETV)非结构蛋白NSP1的抗体,用于鉴定NSP1蛋白及其分布。采用RT-PCR技术扩增GETV的非结构蛋白NSP1基因,构建了NSP1蛋白的原核表达质粒pET-NSP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导大量表达。纯化原核表达的目的蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备了NSP1蛋白的多克隆抗体,间接ELISA效价达1∶10^(5)以上。Western blot和免疫荧光试验(IFA)结果显示,NSP1蛋白多克隆抗体与GETV有良好的反应性。NSP1蛋白多克隆抗体的制备,为进一步研究该蛋白在盖塔病毒复制周期中的功能奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。

猪星状病毒nsP1a/4蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

为了获得猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)重组蛋白nsP1a/4和多克隆抗体nsP1a/4,试验采用PCR技术扩增得到nsP1a/4基因片段,通过双酶切技术鉴定重组表达质粒nsP1a/4-pET-32a。利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达重组蛋白nsP1a/4,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白nsP1a/4表达情况及可溶性。利用Ni-Agarose Resin纯化重组蛋白nsP1a/4,再通过Western-bolt验证。以纯化的重组蛋白nsP1a/4免疫健康新西兰大白兔制备多克隆抗体nsP1a/4,通过Western-bolt检验多克隆抗体nsP1a/4的特异性。结果表明:试验扩增出nsP1a/4基因片段,成功构建出重组表达质粒nsP1a/4-pET-32a,重组蛋白nsP1a/4以包涵体形式在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中大量表达。经Ni-Agarose Resin纯化的重组蛋白nsP1a/4单一,Western-bolt成功鉴定到重组蛋白nsP1a/4,多克隆抗体nsP1a/4能与重组蛋白nsP1a/4发生特异性结合。说明试验成功制备出PAstV的多克隆抗体nsP1a-4。

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测基孔肯雅病毒方法的建立

目的建立一种快速、准确、高灵敏度检测基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)的逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription enzymatic recombinase amplification,RT-ERA)的基因检测技术方法.方法以CHIKV非结构蛋白1(non-structural protein 1,NSP1)基因的保守序列为靶标,根据RT-ERA反应原理设计、合成荧光探针及对应引物,以pUC18为载体构建靶标质粒并在体外转录后作为阳性对照品,将阳性对照品倍比稀释后筛选出扩增效率最高的探针引物组合.利用筛选的探针引物组合,对不同拷贝数的CHIKV进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的最低检出限;再分别以森林脑炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、新布尼亚病毒的RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的特异性.结果在40℃恒温条件下,利用荧光RT-ERA法10 min内可以完成CHIKV核酸扩增,该方法最低检出限可达10拷贝/μL,且当CHIKV核酸扩增为阳性时,其他病毒检测结果为阴性.结论成功建立一种可用于检测CHIKV NSP1基因的荧光RT-ERA法,该方法操作简便、检测限低且特异性好.

鸭星状病毒3型TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据已报道的鸭星状病毒3型(duck astrovirus-3,DAstV-3)毒株的nsp1a基因序列设计并合成特异性引物和探针,经优化反应条件建立一种以nsp1a基因为靶标的检测DAstV-3的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的Ct与标准品模板浓度在2.13×10^(1)~2.13×10^(7)拷贝/μL之间线性关系良好,相关系数R~2和扩增效率分别为0.997和1.09;该方法仅特异性检出DAstV-3核酸,而对其他鸭常见病毒核酸无扩增反应;最低检测下限为21.30拷贝/μL;组内和组间重复试验变异系数分别为0.58%~2.19%和0.68%~2.53%,均低于5.00%;利用所建方法对临床采集的231份疑似DAstV-3感染病料进行检测,发现DAstV-3的阳性率为57.10%(132/231)。结果表明,本试验所建方法操作简便、特异、敏感、重复性好,为DAstV-3的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

建立快速检测委内瑞拉马脑炎的RT-LAMP技术

目的利用逆转录-环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立快速检测委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)的方法。方法针对VEEV nsp1基因序列,设计了5套特异性引物进行筛选,再对反应温度进行优化,最后进行特异性、灵敏性及重复性评价。结果RT-LAMP检测VEEV的最适温度在65℃;同时选取11种病毒进行RT-LAMP,证明了RT-LAMP具有高特异性;运用RT-qPCR与RT-LAMP对比灵敏性,结果表现为RT-LAMP检测的灵敏性超RT-qPCR检测的100倍。针对VEEV进行RT-LAMP的重复性实验,结果为具有较好的重复性。结论RT-LAMP检测VEEV法具有简单快速高效的特点,且装置简单,特异性强、灵敏性高、重复性好。

人星状病毒非结构蛋白酵母双杂交诱饵表达载体构建及酵母转化子特性鉴定

目的构建人星状病毒非结构蛋白3（non．structureproteinla／3，nsPla／3）基因酵母双杂交诱饵重组质粒，电转化酵母感受态细胞后鉴定酵母转化子特性。方法聚合酶链反应扩增人星状病毒nsPla／3编码的基因序列，定向插入到穿梭表达载体pGBKT7改造后的pGBST7中，测序确定无误后将其电转化到Y2HGold酵母感受态细胞中，对细胞特性即nsPla／3一pGBST7诱饵质粒表达产物的毒性和报告基因自激活作用进行鉴定。结果测序结果表明诱饵重组质粒构建正确，阅读框无误。电转化酵母后，其表达产物对酵母细胞无毒性作用，对报告基因亦无激活作用。结论成功构建了用于酵母双杂交的酵母转化子，为研究nsPla／3蛋白与宿主细胞具体作用的靶蛋白和HAstV在细胞内的复制机制奠定了基础。