禽传染性支气管炎病毒nsp4蛋白多克隆抗体制备及其生物学功能研究

【目的】筛选出禽传染性支气管炎病毒(IBV)非结构蛋白4(nsp4)抗原性较好的氨基酸区域并制备多克隆抗体,为进一步研究nsp4蛋白在IBV复制过程中的功能提供物质基础,也为研发IBV新型诊断试剂盒与疫苗打下基础。【方法】对IBV Beaudette株nsp4蛋白进行原核表达,以融合蛋白nsp4作为免疫原免疫健康日本大耳白兔和健康阴性鸡,制备相应的兔多克隆抗体和鸡多克隆抗体,并通过间接ELISA检测、Western blotting检测及IFA验证等对制备获得的多克隆抗体进行生物学功能研究。【结果】选取nsp4蛋白第408~514位氨基酸作为原核表达序列,成功构建了nsp4蛋白原核表达载体pCZN-1-HIS-nsp4和nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA。原核表达的融合蛋白nsp4为13.6 kD,与预期结果相符,能与IBV GX-YL5株和M41株全病毒阳性血清反应。制备的兔、鸡多克隆抗体血清效价分别为1∶128000和1∶6400,均能与融合蛋白nsp4和IBV全病毒反应,且与IBV GX-YL5株、Beaudette株和M41株感染鸡胚肾细胞(CEK)表达的nsp4蛋白反应,还能与转染状态及感染IBV Beaudette株的非洲绿猴肾细胞(Vero)表达nsp4蛋白反应。实时荧光定量PCR检测结果表明,经nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA转染后,Vero细胞的病毒载量呈逐渐上升趋势,即体外过表达nsp4蛋白能促进IBV的复制。【结论】制备获得的2种IBV nsp4多克隆抗体效价高、反应性良好、特异性强,可作为细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具,用于解析nsp4蛋白在IBV增殖过程中的作用机制,也为其他冠状病毒nsp4蛋白的研究提供参考。

人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻作用的初步研究

研究人轮状病毒非结构蛋白NSP4在轮状病毒致病性中的作用。分离得到我国人轮状病毒97SZ8株,以谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌BL-21中表达NSP4蛋白C端86-175氨基酸并用GlutathioneSepharose^(TM) 4B亲和纯化。将纯化蛋白分别以0.4nmol和1.5nmol的剂量腹腔注射新生Balb/C乳鼠,记录腹泻发生和体重变化情况。当注射0.4nmol GST-NSP4_T重组蛋白时,有1只小鼠发生一过性腹泻(1/6),给予1.5nmol重组蛋白时,实验组所有乳鼠都先后出现了腹泻,存在一定的剂量依赖性。本研究初步在新生小鼠建立了一种人轮状病毒腹泻动物模型,该模型有望在人轮状病毒的致腹泻机理、治疗和预防研究中发挥重要作用。

人轮状病毒NSP4蛋白131和133位氨基酸变异对毒力影响的研究

目的研究两株A组人轮状病毒NSP4蛋白131位和133位氨基酸位点的变异对毒力的影响。方法从昆明地区2002年和2005年秋冬季婴幼儿腹泻流行期不同程度腹泻患儿中分离得到两株轮状病毒流行株02k38和05k44,RT-PCR扩增NSP4全长基因,进行cDNA序列测序。通过pGEX-5X-1载体,转化E.coliBL21以谷胱苷肽S-转移酶融合蛋白的形式表达两株病毒的NSP4蛋白C-端86～170位氨基酸（GST-NSP486-170）;并酶切融合头纯化得到两种NSP486-170蛋白,在ICR乳鼠中比较这两种蛋白致小鼠腹泻的差异。结果两种NSP486-170蛋白毒性无差异。结论两株轮状病毒131位和133位氨基酸位点的变异不影响毒力的改变,其致腹泻活性没有明显差异（P〉0.05）。

两株Wa株人源轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致ICR小鼠腹泻的毒力比较

目的研究两株Wa株人源轮状病毒NSP4蛋白139位氨基酸位点的变异对毒力的影响。方法从2002～2004年昆明地区婴幼儿轮状病毒感染者大便样品中,通过RT-PCR,PCR扩增了22株轮状病毒株的NSP4全长基因、cDNA序列,并对cDNA序列测序,发现这些病毒株的NSP4氨基酸序列高度保守,仅在79位、139位氨基酸位点存在差异。选取139位氨基酸不同(V/I)的两株病毒株,在E.coli BL21中,用pGEX5X-1载体融合表达了两株病毒的86～175位氨基酸(GST-NSP4_(86-175);并酶切融合头得到两种NSP4_(86-175)蛋白,在ICR乳鼠中比较这4种不同蛋白致小鼠腹泻的差异。结果发现GST-NSP4_(86-175)蛋白毒性比NSP4_(86-175)蛋白强,而139位氨基酸不同(V/I)的两株病毒株的NSP4_(86-175)蛋白毒性没有明显的差异。结论139位氨基酸位点的变异并不影响NSP4蛋白的毒力改变。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP4细胞核定位研究

为探讨PRRSV非结构蛋白4(NSP4)功能,体外构建了pEGFP-N1-nsp4真核表达载体,转染Marc-145细胞,利用NSP4-GFP融合蛋白携带的绿色荧光标记,研究NSP4蛋白在Marc-145细胞中的定位,并根据蛋白疏水性设计构建含有nsp4基因N端不同长度的重组pEGFP-N1表达载体,转染细胞以进一步了解NSP4蛋白是否存在核定位信号序列及其在细胞中的分布。试验结果表明:融合蛋白主要位于细胞核,部分在胞浆内。PRRSV NSP4蛋白铰链区(hinge region,HR)145～168氨基酸是决定蛋白核内定位的功能区,该片段缺失影响NSP4蛋白进入细胞核。结论:体外转染细胞内表达的NSP4蛋白主要分布在细胞核内,HR区是其核定位信号,NSP4蛋白通过HR区信号作用主动进入细胞核内。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP4切割天然免疫分子NEMO抑制I型干扰素的产生

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵入宿主细胞后能够强烈抑制宿主天然免疫反应。早期研究表明,PRRSV 4个非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP4和NSP11均可以抑制I型干扰素(IFN-I)的产生,但NSP4抑制IFN-I的机理尚无相关报道。本研究显示PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)导致宿主蛋白NEMO(NF-κB essential modulator)被切割,产生一条约40 ku的蛋白条带。通过检测PRRSV编码蛋白酶的切割功能,进一步表明其NSP4是切割NEMO的关键蛋白酶。免疫共沉淀试验表明NSP4与NEMO具有特异性相互作用;激光共聚焦试验结果表明两者在细胞浆中共定位。通过双荧光素酶报告基因试验显示,NSP4过表达可以显著抑制仙台病毒(SeV)和NEMO诱导的IFNβ启动子的激活,导致IFNβ表达量显著下降(p<0.01)。本研究结果表明,PRRSV NSP4可以切割宿主蛋白NEMO,从而显著抑制IFNβ启动子的激活,从分子水平解释了PRRSV NSP4抑制IFNβ产生的机理。

轮状病毒非结构蛋白NSP4的克隆及在毕赤酵母中的表达分析

提取细胞培养的轮状病毒SA11株的基因组RNA,采用RT-PCR技术获得其非结构蛋白NSP4基因,克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,转染毕赤酵母GS115株后,经甲醇诱导表达.结果发现,在上清中没有检测到目的蛋白,表达产物主要为包内表达.通过对不同克隆,不同表达条件进行比较,分析了重组NSP4包内表达的原因.对进一步选择最佳的表达方案奠定了基础.

人轮状病毒VP7、NSP4基因的适应性进化分析

轮状病毒是引起人类和动物急性腹泻的传染病毒,其外壳蛋白VP7决定血清型G型并在诱导产生中和抗体中具有重要的作用,NSP4蛋白作为轮状病毒致泻蛋白,在疫苗研究中亦备受瞩目。本文应用最大似然法分析中国区G1～G3型VP7、NSP4蛋白编码序列。其中VP7序列未发现正选择位点,NSP4中共发现3个正选择位点,这些经历正选择作用的位点位于不同的序列功能区内,暗示这些位点可能对相关的功能贡献决定性作用。本研究的结果为轮状病毒的免疫研究提供参考。

轮状病毒致腹泻机制的研究进展

轮状病毒(Rotavirus,RV)是发展中国家致5岁内婴幼儿胃肠道感染,引起感染性腹泻的重要原因,每年因此而死亡的病例高达600,000多人。[1]近年来对此的研究也越来越多,但是其引起腹泻的具体病理生理机制始终未达成统一的说法。目前主要是有两种假说,即轮状病毒非结构蛋白4(NSP4)假说和肠道神经系统(ENS)假说。对于轮状病毒腹泻的预防及治疗,现阶段主要是进行减毒活疫苗预防,但其疗效不甚令人满意,并且有可能导致肠梗阻。[2-3]本文将对轮状病毒致婴幼儿腹泻的可能机制及其研究进展进行综述,此外,针对其独特的致病机制将讨论轮状病毒感染可能的预防策略。