轮状病毒重组非结构蛋白NSP486-175蛋白的表达及其致泻能力的研究

目的:构建轮状病毒重组NSP486-175表达蛋白,对其致泻能力进行初步评价。方法:从轮状病毒SA11病毒株中提取RNA,逆转录为cDNA,利用PCR技术扩增目的基因并制备E.coliDH5α感受态细胞,酶切pMD19T-NSP4,pMD19T-NSP486-175质粒和pET28a(+)质粒构建轮状病毒重组NSP486-175表达质粒,诱导其表达NSP486-175蛋白,经Glutathione SepharoseTM 4B纯化并鉴定。取新生6天乳鼠40只,随机分为四组,每组各10只。第1组腹腔注射0.5nmol重组蛋白,第2组腹腔注射1.0nmol重组蛋白,第3组腹腔注射1.5nmol重组蛋白,第4组腹腔注射生理盐水作为对照组。观察其对小鼠的腹泻和生长发育的影响。结果:第1组的腹泻率为20%,第2组的腹泻率为30%,第3组的腹泻率为70%,第4组的腹泻率为10%,四组间比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中第3组的腹泻率最高。在体重增长情况方面,在第96小时时,第1组平均增加体重(2.11±0.04)g,第2组平均增加体重(2.06±0.11)g,第3组平均增加体重(1.95±0.15)g,第4组平均增加体重(2.60±1.06)g,四组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:本实验成功重组、表达并纯化出轮状病毒重组非结构蛋白NSP486-175蛋白,证实了其可以引起小鼠腹泻并影响其生长发育。

轮状病毒NSP486-175蛋白对大鼠心肌细胞损伤作用及相关机制研究

目的研究轮状病毒非结构蛋白4的86~175位氨基酸肽段(NSP486-175)对大鼠心肌细胞损伤作用及其相关机制。方法利用前期制备好的活性NSP486-175蛋白处理大鼠H9C2心肌细胞,观察处理后的细胞生长形态变化,检测细胞培养液中LDH活性;Fluo-3AM标记细胞内游离的钙离子,蛋白质处理细胞后,用激光共聚焦显微镜检测大鼠心肌细胞内钙离子浓度变化。流式细胞术分析蛋白质对细胞凋亡的影响,RT-PCR检测Bax、Bcl-2、caspase-3、78 kDa葡萄糖调控蛋白(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及caspase-12 mRNA转录水平;Western blot检测caspase-3、caspase-8、caspase-9、GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达水平。结果正常生长的心肌细胞呈典型的成肌样细胞形态,细胞呈梭形,边界清晰。纯化的NSP486-175蛋白刺激后出现明显的细胞病变效应,细胞空泡变性,皱缩变圆,细胞碎裂;蛋白质处理组细胞培养液中的LDH活性均增高;与对照组相比,NSP486-175处理组细胞的钙离子荧光增强,细胞凋亡率增高,细胞凋亡因子caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax-2表达上调,内质网应激(ERS)经典标志分子GRP78、CHOP和caspase-12表达上调。结论NSP486-175对大鼠心肌细胞具有损伤作用,这可能与它导致细胞内钙超载,并引起内质网应激进而诱导心肌细胞凋亡坏死有关,为轮状病毒肠道外播散感染和致心肌损伤提供了一定的理论依据。

重组轮状病毒NSP4蛋白对大鼠神经元细胞内钙离子的干扰及损伤作用

目的研究轮状病毒非结构蛋白4的86～175位氨基酸肽段（amino acid residues86to 175 of nonstructural protein4，NSP486-175）对大鼠神经元细胞内钙离子的干扰及损伤作用。方法利用前期制备好的活性NSP486-175蛋白处理原代培养的大鼠神经元细胞，观察蛋白质处理后细胞的形态变化，检测细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性；Fluo-3AM标记细胞内游离的钙离子．蛋白质处理细胞后，用激光共聚焦显微镜检测神经元细胞内钙离子浓度变化。结果正常生长的神经元细胞胞体丰满，呈不规则形或梭形，细胞突起数量较多并且较长，纯化的NSP4 86-175 蛋白刺激后的大鼠神经元细胞出现明显的细胞病变效应，细胞密度稀疏，细胞胞体皱缩，细胞突起数量减少；蛋白质处理组细胞培养液中的LDH活性均增大；外源性添加NSP4 86-175 能引起神经元细胞内荧光强度和分布改变。结论NSP4 86-175 对大鼠神经元细胞具有损伤作用，这可能与它导致细胞内钙库释放引起的钙离子浓度升高有关，为轮状病毒肠道外播散感染和致病提供了一定的理论依据。