猪流行性腹泻病毒Nsp7基因真核表达载体的构建及表达

PEDV Nsp7蛋白是猪流行性腹泻病毒的一种非结构蛋白,它在病毒复制过程中表达,并与感染细胞的内质网和细胞膜相关,是病毒基因组翻译的两个大型复制酶的关键辅助因子。为了对PEDV Nsp7蛋白进行更加深入的研究,试验从病变猪小肠中提取总RNA,并通过RT-PCR扩增获取PEDVNsp7基因,最终将其连接到pCMV-Myc载体上。试验结果显示,成功构建了pCMV-Myc-Nsp7的重组质粒,并通过Western Blot技术和免疫荧光技术在真核细胞中验证了其蛋白表达情况,为后续研究PEDV Nsp7的生物学功能奠定了良好的基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp7蛋白的表达与纯化

为了解nsp7重组蛋白的免疫学活性,采用RT-PCR的方法从猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PRRSV)BJ-4毒株中扩增得到nsp7基因,将基因连接到pET-28a载体并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,利用Ni-NTA进行亲和纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行分析和鉴定,通过间接ELISA方法研究了重组蛋白的免疫学活性。结果表明,成功制备了nsp7重组蛋白,间接ELISA结果表明,重组蛋白具有良好的免疫活性,为建立nsp7特异性抗体的间接ELSIA检测方法及PRRS诊断试剂盒的研制奠定了基础。

基于PEDVNsp7蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

本研究旨在建立检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)不同毒株抗体的间接ELISA方法。试验以纯化的非结构蛋白7(nonstructural protein 7,Nsp7)作为包被抗原,通过优化ELISA反应条件建立了PEDV不同毒株抗体检测的间接ELISA方法。结果显示,其最佳反应条件为:抗原包被量为0.2μg/孔,包被条件为37℃孵育1h后4℃过夜;血清稀释度为1∶300,作用时间为2h;酶标二抗最适稀释度为1∶10 000,作用时间为1.5h;TMB显色液作用时间为15min。在优化条件下,临界值的判定标准为:样品S/P值>0.1694判为阳性,S/P值<0.1398判为阴性。所建立的ELISA方法特异性、重复性及敏感性均良好。用所建立的ELISA方法对40份来自于疑似猪PEDV血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒检测之间的符合率为95%。本研究建立的ELISA方法在临床上可用于PEDV不同毒株抗体水平的检测,也有用于PEDV早期诊断的潜质,从而为制定有效防控PEDV的措施提供一定的参考依据。

猪繁殖呼吸综合征病毒的NSP7蛋白密码子优化和表达及其免疫学活性鉴定

目的:提高蓝耳病毒NSP7基因的表达水平和促进其可溶性表达,验证重组蛋白的免疫学活性,为猪繁殖呼吸综合征血清学鉴定奠定基础。方法:通过同源性分析软件分析28株NSP7基因的保守性,抗原表位预测网站预测NSP7蛋白的抗原表位,可溶性表达预测网站分析NSP7基因可溶性表达概率,随后挑选保守性高的NSP7基因进行密码子优化并合成,最后利用SDS-PAGE探究重组蛋白表达产物存在的形式和表达的最佳条件,Western blot和ELISA探究重组蛋白的免疫学活性。结果:蓝耳病毒NSP7基因较保守,抗原表位较多,经过密码子优化后以可溶性形式表达; SDS-PAGE分析表明重组蛋白的相对分子质量约为49 k D,最佳表达条件为34℃0. 8 mmol/L IPTG 7 h; Western blot和ELISA结果显示纯化的蛋白具有免疫学活性。结论:重组蛋白以可溶性形式表达且具有免疫学活性,为PRRSV血清学鉴定奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白7真核表达及亚细胞定位

【目的】对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白7(nonstructural protein 7,NSP7)进行真核表达及生物信息学分析,从而推测其在PRRSV复制过程中的功能。【方法】按照GenBank数据库中NSP 7基因序列合成目的基因并构建真核表达载体P3×FLAG-CMV-NSP7,瞬时转染Marc-145细胞后通过Western blotting验证蛋白表达,通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)对NSP7蛋白进行亚细胞定位,利用生物信息学分析软件预测NSP7蛋白的理化性质、结构及功能。【结果】成功构建P3×FLAG-CMV-NSP7真核表达载体;Western blotting结果显示,获得大小约为2.7 ku的目的条带,证实重组载体在Marc-145细胞中高效表达。IFA结果证实在PRRSV感染初期NSP7蛋白大部分分布于细胞质中,随着感染时间延长NSP7蛋白由细胞质进入细胞核。生物信息学分析结果显示,NSP7蛋白由259个氨基酸编码,分子式为C _(1284) H _(2020) N _(348) O _(379) S_( 8),分子质量为28652.75 u,理论等电点为5.88,为不稳定、亲水蛋白。结构预测发现,NSP7蛋白二级结构包括α-螺旋和β-转角,占比分别为35.91%和5.41%。核定位序列分析发现,NSP7蛋白具有一段跨膜序列RLNKKKRRRMEAVGIF。【结论】本研究成功构建高效表达的PRRSV NSP7真核表达载体,在PRRSV感染初期NSP7蛋白分布于细胞质,感染后期分布于细胞核,NSP7蛋白存在核定位序列。

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的荧光微球免疫学检测方法的建立

为了建立一种高通量、重复性好、特异性高的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的快速检测方法,本研究用纯化后的PRRSV非结构蛋白7(Nsp7)重组蛋白作为偶联抗原建立PRRSV抗体的荧光微球免疫学检测方法。对检测方法进行分析结果表明,批内、批间变异系数分别为3.2%、4.2%,与其他常见猪病阳性血清无交叉反应。当单抗浓度低至1 ng/mL时,该方法仍具有高灵敏度。本研究建立的荧光微球免疫学检测方法能快速检测临床样本PRRSV抗体,为PRRSV检测提供了一种新方法。