新型阿卡斑病毒NSs蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】对新型阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)非结构蛋白(non-structura,NSs)进行生物信息学分析,进而制备抗多克隆抗体,为新型AKAV检测及功能研究提供必要材料。【方法】使用蛋白生物信息学在线分析网站,对新型AKAV NSs蛋白进行系统分析。克隆NSs全长基因,利用大肠杆菌表达系统表达NSs重组蛋白,优化蛋白诱导条件并分析重组蛋白的可溶性;收获破碎菌体,经8 mol/L尿素变性、Ni 2+-NTA亲和层析纯化、透析及浓缩后进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定;将纯化的重组NSs蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;应用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)测定多克隆抗体效价及特异反应性。【结果】生物信息学分析表明,NSs蛋白由91个氨基酸残基构成,等电点为12.10,属于碱性蛋白,不稳定指数约为79.04,平均亲水性为指数为―0.059,为不稳定的亲水蛋白;无跨膜区和信号肽,属于非分泌蛋白。试验成功构建了NSs蛋白原核表达载体pET-32a-NSs,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定显示,成功表达重组NSs蛋白,分子质量为29.3 ku,主要以包涵体形式存在,与生物信息学分析结果一致;制备的多克隆抗体效价可达1∶16384000,Western blotting和IFA结果表明所制备抗体能够与NSs蛋白发生特异性反应,具有较好的特异性。【结论】试验成功获得纯化的新型AKAV NSs蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性;制备获得效价高、特异性好的多克隆抗体,为后续新型AKAV疫苗开发、检测及NSs蛋白功能研究提供了基础。

利用酵母双杂交技术筛选鉴定与番茄环纹斑点病毒NSs蛋白互作的西花蓟马蛋白

【目的】筛选鉴定西花蓟马Franiklinella ocicdentalis体内与番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot virus,TZSV)NSs蛋白互作的介体因子。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白;进行序列分析鉴定后,将捕获的蛋白与NSs基因回转到酵母细胞,利用营养缺陷型培养基鉴定蛋白互作情况。再利用GST Pull-down技术验证TZSV NSs与鉴定出的西花蓟马蛋白的体外互作关系。【结果】构建了TZSV NSs的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-NSs,确定了诱饵质粒对酵母AH109细胞无毒性,并且无自激活活性。序列分析发现与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白为类电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion-selective channel-like,VDAC)。酵母回转实验显示TZSV NSs与西花蓟马VDAC在酵母细胞内存在特异性互作。GST Pull-down结果表明TZSV NSs与西花蓟马VDAC在体外存在相互作用。【结论】通过酵母双杂交和GST Pull-down技术,分别在酵母细胞内和体外证实了TZSV NSs和西花蓟马VDAC存在特异性互作。这些结果有助于揭示西花蓟马VDAC蛋白调控西花蓟马持久传毒的机制,为虫传病毒病的防治提供理论基础。

布尼亚病毒非结构蛋白NSs与RNA沉默

布尼亚病毒科含5个属,350多种病毒,寄主范围包括植物、动物和人类,主要通过节肢动物传播(仅有汉坦病毒属通过啮齿动物传播),其中大部分病毒危害严重,影响农业生产,威胁人类和动物健康,造成重大经济损失。NSs蛋白是布尼亚病毒S RNA编码的非结构蛋白质,可以抑制RNA沉默,在侵染介体和寄主的过程中起时发挥重要作用。在植物寄主中,NSs蛋白通过与病毒dsRNA结合、抑制dsRNA次生扩增、长距离传播等机制抑制RNA沉默;在动物、人类寄主以及传播介体中,多种证据表明,NSs蛋白也能抑制RNA沉默。RNA沉默是植物和节肢动物中主要的抗病毒机制之一,NSs蛋白抑制RNA沉默对于病毒成功侵染寄主或传播介体非常重要。本文就近年来NSs蛋白在抑制RNA沉默方面的研究做一综述。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒非结构蛋白NSs的原核表达及初步鉴定

目的克隆、表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)非结构蛋白NSs,对其功能初步鉴定。方法采用PCR法扩增经密码子优化后的SFTSV NSs基因,并克隆至PGEX-4T-2载体中,构建原核表达载体PGEX-4T-2-NSs,经酶切、测序鉴定后转化表达菌BL21(DE3),再经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NSs融合蛋白,用Western Blot验证融合蛋白GST-NSs的抗原性。结果成功构建了GST-NSs融合蛋白原核表达载体,并在BL21细菌中获得高效表达;纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性。结论实现了SFTSV重组NSs蛋白的原核高效表达,为进一步深入研究其结构与功能奠定了基础。

丙肝病毒基因在肝门部胆管癌组织中的表达及其意义

目的 探讨丙肝病毒核糖核酸 (HCVRNA)及蛋白在肝门部胆管癌组织中的表达及其生物学意义。方法 应用套式逆转录 多聚酶链反应 (nestedRT PCR)和免疫组织化学技术检测 36例肝门部胆管癌患者癌组织和癌旁组织中HCVRNA、非结构蛋白 (NS5)蛋白水平的表达。结果 36例肝门部胆管癌患者癌组织和癌旁组织中HCVRNA和NS5蛋白阳性表达率为 83.3% ( 30 /36)、47.2 % ( 1 7/36) ,2种组织间的差异有非常显著性 (P <0 .0 1 )。癌组织和癌旁组织中NS5蛋白阳性表达率分别为 36.1 % ( 1 3/36)、2 2 .2 % ( 8/36) ,2种组织间差异无显著性 (P >0 .0 5)。HCVRNA阳性表达与肝门部胆管癌的发生部位、病理类型、分化程度、有无转移、丙氨酸转移酶 (ALT)高低以及有无输血史、乙型肝炎表面抗原阳性 [HBsAg( + ) ]、肝硬化、黄疸等无关 (P >0 .0 5) ,仅与是否伴有血清抗HCV阳性有关 (P <0 .0 5)。结论 肝门部胆管癌组织中有HCV基因及其产物的高表达 。