NUDT9通过稳定MCM3的蛋白表达促进恶性肿瘤增殖

目的 探讨ADP-核糖焦磷酸酶NUDT9促进肿瘤增殖的分子机制。方法 分析GEPIA2数据库中NUDT9在多种肿瘤中的表达水平;利用Western Blot免疫印迹法检测蛋白表达水平;通过克隆形成数量检测细胞增殖速度;使用流式细胞术检测细胞周期变化;EdU染色实验检测S期细胞比例;转染外源质粒SFB-NUDT9联合免疫共沉淀法和定量质谱技术鉴定NUDT9的相互作用蛋白;分别设计两条sgRNA和siRNA在肿瘤细胞中沉默NUDT9基因的表达,结合免疫印迹法检测NUDT9蛋白表达水平及其对细胞增殖相关蛋白表达水平的影响。结果 GEPIA2数据库显示NUDT9在多种肿瘤细胞中高表达;利用CRISPR和小干扰RNA技术均有效沉默NUDT9基因的表达;克隆形成、流式细胞术及EdU增殖实验均表明敲低NUDT9后抑制癌细胞的增殖及G1/S期转换;转染外源质粒SFB-NUDT9结合免疫沉淀法和定量质谱技术鉴定出与细胞增殖相关的NUDT9互作蛋白MCM2-7;通过转染siRNA沉默NUDT9再结合免疫印迹法,发现NUDT9的敲低影响MCM复合物中MCM3的蛋白表达水平;最后转染siRNA沉默MCM3基因的表达,克隆形成和EdU增殖实验均显示MCM3的敲低影响肿瘤细胞的增殖,S期细胞比例减少。结论 NUDT9通过调控MCM3的蛋白表达,促进S期细胞周期进程,对肿瘤细胞的增殖过程起到非常重要的作用。

小鼠Nudt9基因原核载体的构建及其生物信息学分析

利用分子克隆的方法,将小鼠Nudt9基因克隆至原核表达载体,并进行PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定;再运用DNAMAN和DNATAR对基因进行同源性分析及抗原肽分析,同时在线分析小鼠Nudt9蛋白的信号肽、跨膜区域、结构域、N-糖基化位点以及磷酸化位点。本研究成功获得重组pET28a-Nudt9质粒,并从基因及氨基酸组成上分析该蛋白的特性,从而挖掘出一些基因及蛋白生物信息。