嗜油菌NY3与土著菌FF生物强化降解石油烃的协同机理研究

优良菌与土著菌的相互作用关系是影响生物强化降解石油烃效果的关键因素。前期研究发现,嗜油菌NY3生物膜对2 g/L含油废水中石油烃的降解率可保持在83%~95%,处理阶段与恢复阶段生物膜上NY3菌及FF菌的生物量存在此消彼长的变化趋势,本文旨在探明该变化趋势的产生机理。研究结果表明:NY3菌对长链烷烃(C30~C34)的降解率高于FF菌,FF菌对中长链烷烃(C13~C29)、蒽、菲的降解率高于NY3菌;NY3菌在中性、弱碱性和低盐度环境下对石油烃的降解率高于酸性和高盐度环境,FF菌在中性、弱酸性、高盐度环境下对石油烃的降解率高于碱性和低盐度环境;NY3菌分泌的鼠李糖脂和绿脓菌素可促进FF菌的生长,但FF菌分泌的海藻糖脂可抑制NY3菌的生长。据此可知,NY3菌与FF菌能协同降解石油烃,但因胞外分泌物对NY3菌和FF菌的作用不同,致使NY3菌和FF菌的生物量出现此消彼长的变化趋势。

铜绿假单胞菌NY3好氧降解四溴双酚A的特性研究

为发掘铜绿假单胞菌NY3对有机污染物更多的降解功能,探究该菌好氧降解四溴双酚A(TBBPA)的特性。结果表明,NY3菌能以四溴双酚A为唯一碳源和能源好氧生长,并在TBBPA质量浓度为20 mg/L时,脱溴率达到51.90%。该菌生长量越大,对TBBPA降解率和脱溴率越高。TBBPA质量浓度为60 mg/L时,外加共代谢碳源葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠、乙醇均能明显提高NY3菌生长量,且使脱溴率分别提高21.7%、13.4%、13.11%、18.5%、18.3%、17.1%。NY3菌好氧降解TBBPA优化条件为最佳氮源(NH4)2SO_4、pH=8.0、温度(30±1)℃、摇床转速150 r/min的条件下振荡培养。在NY3菌降解TBBPA过程中,转化的主要中间产物包括3,3',5-三溴双酚A、4-(2-羟基-异丙烷基)-2,6-二溴-苯酚、2,6-二溴-4-异丙烷基-苯酚、3,3',5-三溴-5'-羟基-双酚A、4,5-二羟甲基-5-(3,5-二溴-4-羟苯基)-2-己烯酸,根据转化产物分析,NY3菌降解TBBPA主要通过脱溴、羟基化,然后开环裂解,进一步脱羧等途径。这是首次报道铜绿假单胞菌具有降解含溴阻燃剂的功能,且质荷比为477和407的2种中间产物也鲜有报道。

含油废水理化特性对NY3菌除油效率的影响

为了将NY3菌实际应用于处理高浓度含油废水,采用摇瓶试验方法,研究了含油废水的理化特性对NY3菌去除高浓度油的影响。结果表明,NY3菌能耐高浓度油,降解石油烃的最佳p H值为7.5,24 h对质量浓度为2 000 mg/L的高含油废水中烃类的去除率高达72%。适度的含盐量可提高NY3菌降解原油的能力,与未外加Na Cl相比,2 g/L Na Cl使NY3菌降解原油效率提高约20%。Sn2+、Ag+、Pb2+、Cd2+、Hg2+等均能对NY3菌降解石油烃的效率产生抑制作用,其中Ag+作用最明显,使NY3菌24 h烃降解效率降低约38.8%。硝酸铵为NY3菌降解石油烃的最佳氮源,外加3.71 g/L硝酸铵,24 h内对油的去除率高达81.75%。外加表面活性剂(SDS)使降解体系中NY3菌细胞数量减少,同时使NY3菌降解油的效率降低约43.5%。

草酸对铜绿假单胞菌NY3降解烃的作用研究

研究了草酸对NY3菌(Pseudomona aeruginosa NY3)降解烷烃的影响作用。研究发现,草酸能促进菌体降解十四烷,且最佳投加浓度在1 g/L左右。投加草酸8 h内对十四烷去除率最大,可提高约15.2%。草酸促进降解主要是其改变菌体胞外液分泌成分。紫外光谱结果表明,共存草酸使胞外液中吩嗪-羧酸PCA分泌量大大提高。从气相和液质测定结果看,NY3菌代谢体系中,胞外液中PCA分泌量与十四烷的同步降解率呈正相关。体外实验表明,将试剂级PCA投加在NY3菌以"十六烷+草酸"为碳源生长的胞外液中,发现PCA投加量与其对十四烷的降解效果也呈正相关。与未投加PCA相比,PCA投加2μmol/L,12 h内胞外液对十四烷的去除率提高了约13.1%。结果表明,草酸能促进NY3菌降解十四烷主要是由于其可使菌体胞外液中PCA的分泌量大大提高。本文研究了共存草酸在铜绿假单胞菌NY3降解烃类污染物过程中的作用及其作用机理,为后续优化设计铜绿假单胞菌NY3处理实际烃类污染物的应用提供参考。

NY3菌固定化及生物膜处理含油废水的研究

利用嗜油菌NY3菌的固定化生物膜处理含油废水.用静态曝气法确定固定化时间、载体量、固定化液初始pH值.确定生物膜处理运行的HRT,并评估生物膜循环使用的可能性.结果表明,载体10 g/L,pH7.5~9.0,固定51 h,膜生物量达488.32 mg/g.其处理含油废水最佳HRT为6 h,出水油量在1.38~3.2 mg/L.废水处理后,将载体置于营养液中培养15 d,膜上NY3菌能将所吸附的油降解,使其恢复活性,并可循环利用.

培养基组成对铜绿假单胞菌NY3产鼠李糖脂性能和结构的影响

铜绿假单胞菌NY3能产鼠李糖脂,不同碳源、氮源培养基对所产鼠李糖脂性能和结构有一定影响。实验结果表明(1)菜籽油和橄榄油为碳源,所产鼠李糖脂含糖量低,发酵液有好的排油效果,表面张力较低;丙三醇和葡萄糖为碳源,所产鼠李糖脂含糖量高,其水溶性好。(2)菜籽油为碳源,硝酸铵和硝酸钠为氮源时,发酵液具有极好的排油和乳化性能,表面张力下降显著;氯化铵为氮源时,发酵液的排油性能和乳化性能很差,表面张力接近蒸馏水的,鼠李糖脂含糖量较低;蛋白胨为氮源,发酵液具有较好的排油和乳化性能。

绿脓菌素促进铜绿假单胞菌NY3降解烃的作用机制

绿脓菌素(Pyo)的分泌是铜绿假单胞菌NY3最为显著的特征之一,前期实验观察到该菌降解烃时,Pyo分泌量常与烃的降解效率成正相关性,但其在污染物降解中的作用尚未受到关注,且机制不清楚.以共存戊二酸为高分泌Pyo的体系和试剂级Pyo标准物为基础,研究了NY3菌降解烃时,Pyo对细胞内氧化还原酶及其比酶活力和胞外电子传递速率等因素的影响作用.结果表明,戊二酸能够明显提高Pyo的分泌量,相较于无戊二酸体系提高了86.6%,且随Pyo分泌量增加,NY3菌对十六烷去除率增加了16.29%;NY3菌分泌Pyo有利于提高其胞内烷烃氧化酶的活力,在菌体生长至72h、Pyo投加量分别为200,300μL时,相较于未投加Pyo体系,烷烃氧化酶比活力分别提高了121.8%和346.5%.同时Pyo存在下将胞外电子传递速率提高了近7倍,从而增加其对十六烷的降解速率.NY3菌分泌Pyo能通过提高胞内酶活性和胞外电子传递速率而促进NY3菌降解十六烷.

绿脓杆菌螯铁蛋白分泌及其对铜绿假单胞菌NY3降解烃类的影响作用

为研究铜绿假单胞菌NY3胞外分泌物PCH对菌体自身及其对烃类降解的作用,对PCH影响烃类降解的效率及机理进行研究。分别以NY3菌降解烃类污染物的无机盐培养基和M9培养基为例,研究PCH含量对NY3菌降解十六烷活性的影响。结果表明,PCH分泌量与对NY3菌生长量及其对十六烷的比降解率呈负相关。将PCH加入到NY3菌降解十六烷体系中,发现少量PCH对NY3菌生长及其十六烷降解效率有促进作用,PCH浓度超过5.2 mg/L时,十六烷降解率及菌体的生长明显被抑制。进一步研究发现,PCH浓度过高会对NY3菌自身造成一定损害,抑制NY3菌烷氧化酶活性,同时增强降解体系中自由基信号强度,从而导致细胞对十六烷降解能力下降,同时使细胞大量死亡。该研究结果表明,使用NY3菌修复石油烃污染物过程中应严格控制PCH分泌量,为NY3菌在石油烃修复的应用提供参考。

铜绿假单胞菌NY3胞外分泌物对降解烃类的影响作用

为了研究铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa NY3胞外分泌物对烃类降解的作用,对胞外分泌物影响烃类降解的效率进行了研究。研究发现,NY3菌以LB培养基和以烃类为唯一碳源的无机盐培养基培养得到的种子液,离心并洗涤菌体后,菌细胞代谢烃类效率明显下降。分别利用盐析和溶剂萃取法,提取种子液上清液中胞外大分子和小分子,且投加在NY3菌(离心后的菌细胞)降解十四烷的无机盐培养基中,发现24 h内外加胞外大分子化合物,使NY3菌对十四烷去除率可提高约14%,而投加小分子化合物使NY3菌24 h内对十四烷去除率提高约6%。利用SDS-page聚丙烯酰氨凝胶电泳分离胞外大分子,结果发现主要是该菌胞外所分泌的蛋白或多肽类,主要有3个条带,它们的分子量约在35~55 k D范围内,其对烃降解促进作用机理有待进一步验证。利用飞行质谱(LCMS-IT-TOF)鉴定胞外小分子分泌物,结果表明在本研究条件下,它们均为氧化还原反应活性物,可以加快反应体系中电子传递速度,促进底物的氧化还原反应。

发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3所产鼠李糖脂结构及性能的影响

为研究发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3所产鼠李糖脂结构及性能的影响,从鼠李糖脂的结构组分、性能和应用效果等方面展开研究。薄层实验证明两种鼠李糖脂均含有单糖脂和双糖脂。液质分析发现以橄榄油作碳源时,鼠李糖脂中双糖脂(Rha-Rha-C5-C6:1和Rha-Rha-C8-C8:2)比例更大,约为73.09%。而地沟油作碳源时,单糖脂(Rha-C10-C10和Rha-C16-C16:2)的比例更高,约为76.91%。橄榄油和地沟油为碳源的鼠李糖脂的临界胶束浓度(CMC)分别为55 mg/L和80mg/L。相同投加量时,前者乳化性和乳化稳定性均优于后者。NY3菌降解含油污泥时,投加双糖脂含量高的鼠李糖脂会使C16-C30直链烷烃的去除率更高。

预水解发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3产鼠李糖脂特性及应用效能的影响研究

发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3(Pseudomonas aeruginosa NY3)产鼠李糖脂(Rhamnolipids,Rha)的特性影响较大。研究了利用废弃动物油作为发酵碳源时,其碱预水解和酶预水解对NY3菌发酵产鼠李糖脂产量、产物结构和性能的影响,从碳源水解酸值与水解产物、鼠李糖脂组分结构和实际应用效果进行了研究。碱、酶预水解实验发现,碳源酸值由初始的19.81 mg/g分别提高到72.04 mg/g和73.75 mg/g,气质联用(GC-MS)分析检测结果表明,碱、酶预水解后,碳源均释放7种C14-C18碳链的脂肪酸,鼠李糖脂产量由未预水解的8.28 g/L分别提高到15.35 g/L和17.63 g/L。液质联用(LCMS-IT-TOF)分析结果表明,用未预水解及碱、酶预水解碳源发酵时,NY3菌所产鼠李糖脂中单糖脂含量分别为62.07%、65.67%、87.32%。利用NY3菌在中试条件下处理高浓度石化企业油污泥,发现鼠李糖脂能促进NY3菌去除油污泥中的石油烃,且促进作用强弱顺序为未预水解产Rha>碱预水解产Rha>酶预水解产Rha。

铜绿假单胞菌NY3所产表面活性剂对原油降解的影响

铜绿假单胞菌NY3是从石油污染土壤中分离出的一株能快速代谢疏水性化合物的菌种。研究了该菌产表面活性剂及对原油降解的作用。实验表明,在敞开体系中,投加82 mg/L NY3菌产的鼠李糖脂,240 h能使NY3对原油的降解率提高50%。投加甘油使NY3产鼠李糖脂与降解原油同步进行,与投加鼠李糖脂对原油降解的促进作用相近。投加9‰甘油使NY3在168 h对原油的降解率提高43%。NY3菌能同时降解原油中的直链烷烃及菲(Pr)和芘(Ph)等多环芳烃。在敞开体系中用少量甘油使产鼠李糖脂和降解原油同步进行,节约处理费用。研究结果为NY3菌株在露天石油污染环境修复中的应用奠定了基础。

鼠李糖脂在铜绿假单胞菌NY3代谢烃过程中的生理作用

为了解鼠李糖脂在菌代谢烃过程中所起的具体作用,对NY3菌体生理生化指标进行测定,研究了NY3菌降解烃过程中,鼠李糖脂促进烃降解与细胞生理特性变化规律的相关性。结果表明,投加60、100和140 mg/L鼠李糖脂,能使正十六烷降解率分别提高23.7%、48.3%和32.2%,且产酸明显。鼠李糖脂能加快疏水性有机物的传质速度,与未加鼠李糖脂相比,鼠李糖脂浓度为100和140 mg/L时,菌细胞内积聚的正十六烷量增加12.5%和37.69%。鼠李糖脂存在下,NY3菌细胞内正十六烷吸收是一个积累和消耗相互交替的动态过程。鼠李糖脂使菌体细胞中疏水性脂类的相对含量和细胞表面的负电荷明显增加,但使所生长的细胞内脂多糖含量明显减少,生长过程投加鼠李糖脂浓度为60、100、140和200mg/L时,细胞中脂多糖含量分别减少45.65%、58.13%、45.61%、和59.44%。因此,鼠李糖脂能加快NY3菌对十六烷的降解,同时对代谢过程中菌体的生理生化特性有明显的改变。

鼠李糖脂对铜绿假单胞菌NY3表面特性及其烃降解效率的影响

研究了鼠李糖脂对NY3菌表面特性及其降解烃类物质的影响作用.结果表明,与未加鼠李糖脂相比,原油含量为1000 mg·L-1,鼠李糖脂100 mg·L-1时,生长24和48 h,NY3菌细胞净生长量分别提高8.60和6.68倍,且产酸明显,原油中正二十六烷至正三十三烷降解效率可提高约60%.分别以LB培养基和十六烷为唯一碳源的无机盐培养基生长的NY3菌体(OD400nm=1.68±0.08),与100 mg·L-1的鼠李糖脂作用1.5h,菌体表面疏水性分别增加32%、6%;且以LB培养基生长的NY3菌细胞,在鼠李糖脂和十六烷存在下作用90 min,菌细胞所积聚的正十六烷量比未加鼠李糖脂时增加了1.10 nmol·mg-1干菌,说明鼠李糖脂能加快疏水性有机物的传质速度.红外光谱分析结果表明,与未加鼠李糖脂相比,鼠李糖脂使菌体细胞中疏水性脂肪链的相对含量明显增加.因此,鼠李糖脂能增加菌体的表面疏水性,加快烃类的传质速率,从而促进NY3菌对烃的降解.

嗜油菌NY3对蜡质油污泥无害化处理

蜡质油污泥(WOS)成分复杂,含大量老化原油、蜡质油、沥青质及其他化学药剂,属危险性固体废弃物,大量排放已成为石化企业可持续发展的障碍。研究利用铜绿假单胞菌NY3处理高浓度WOS的条件,结果表明,WOS∶木屑(m/m)(d=0.30 mm)7∶1并结合热熔分散为最佳油污泥预处理条件;液相降解体系含油量为24.5 g/L时,6 d内,油泥中C20以下的正构烷烃完全被去除,C21~C34和C35~C38大分子量正构烷烃去除率分别在91%~99%和78%~89%之间。添加鼠李糖脂能明显提高长链烃和多环芳烃的降解率。6 d内210 mg/L鼠李糖脂使C29~C38的降解率提高17.27%~36.65%,芘、菲分别提高13.67%和16.12%。添加葡萄糖和Fe2+的条件下,NY3菌可将油污泥转化成为糖蛋白,产量达28 g/L。

铜绿假单胞菌NY3及突变株代谢油污泥同步产胞外聚合物的特性

油污泥属危险性固体废弃物,大量排放已成为石化企业可持续发展的障碍。利用铜绿假单胞菌NY3及突变株,将油污泥转化为生物质,并研究了其特性。研究表明,NY3、NB1D、NB2D及NB12DD均能降解油污泥中烷烃,但NY3、NB1D和NB2D菌对分子量较高烷烃(从C17~C32)的降解率比双突变菌NB12DD分别平均提高19.68%、28.76%和24.04%。铜绿假单胞菌NY3及突变株能直接将油污泥中烃类转化为胞外聚合物。与未加共代谢碳源相比,葡萄糖作为共代谢碳源时(培养液中表观油浓度达15 g·L^(-1)),培养120 h后,NY3、NB1D、NB2D、NB12DD菌胞外聚合物产量分别提高83.3%、79.8%、20.6%和62.9%,且碱性条件有利于各菌株高效降解油转化为生物质,pH为8~9时,其胞外聚合物产量均最高,分别达到8.1、4.34、4.94和7.15 g·L^(-1),野生菌NY3转化碳源为生物质转化率最高,为52.75%。结构和组成分析表明,胞外聚合物主要为糖蛋白,蛋白4.4%,总糖44.1%,蛋白与糖的连接方式为O-糖苷键链接,91.1%大分子粒径分布在33.0~716.9μm范围。

铜绿假单胞菌NY3及其突变株好氧降解四溴双酚A特性研究

为明确铜绿假单胞菌NY3 2个烷羟化酶基因alk B1和alk B2基因在该菌代谢四溴双酚A中的作用,研究了野生NY3菌及其突变菌株(NB1D、NB2D及NB12DD)对四溴双酚A好氧降解特性.研究表明,NY3、NB1D、NB2D及NB12DD菌株均能以四溴双酚A为单一碳源和能源进行生长,并对四溴双酚A进行一定程度上的降解.NY3菌中alk B1基因和alk B2基因的缺失对NY3菌株在四溴双酚A中的生长有抑制作用,而且alk B1基因和alk B2基因在NY3菌降解四溴双酚A中起一定的作用,但不完全,说明NY3菌中还存在其他影响四溴双酚A降解的基因.缺失alk B2基因的突变株NB2D在高浓度的四溴双酚A溶液中降解转化率最少,说明alk B2基因的缺失,对NY3菌降解高浓度四溴双酚A碳源更重要.加入同一易降解共代谢碳源,野生株NY3菌及其各突变株生长特性无明显差异,然而,因共存碳源种类不同,同一菌株细胞生长量、对四溴双酚A降解及其脱溴效率等特性差别明显.加最佳共代谢碳源乳酸钠的体系内,突变株NB2D存在下易积累中间产物3,3',5-三溴双酚A和2-溴-4(异丙基-溴苯)-苯酚等直接脱溴产物,说明alk B1基因可能为NY3菌株代谢四溴双酚A脱溴时的关键基因.

生物膜处理高含油废水及膜表面微生物群落特性研究

利用单一铜绿假单胞菌NY3生物膜在敞开体系中(非无菌条件下)处理石油废水,结果发现,生物膜可高效率去除高浓度含油废水中的油类物质.在2g/L含油水样中,连续运行25d,石油烃去除率可持续保持约91.1%.停止进水后,曝气可使生物膜活性恢复.自然环境中,配伍于NY3菌生物膜中的微生物主要有芽孢杆菌、假单胞菌和红球菌属,其中在实验室能够培养出来的微生物经16Sr RNA鉴定分别属于红球菌属和芽孢杆菌属,经检测,2株菌均有高的石油烃降解效率.

铜绿假单胞菌降解菲的产物鉴定及代谢过程

研究了1株能快速降解疏水性化合物的铜绿假单胞菌NY3对菲的降解机理。GC-MS分析表明,该菌代谢菲的各个阶段,能够被检测到的主要酸性产物有1-羟基-2-萘甲酸、α-萘酚、邻羟基苯基羰基乙酸、水杨酸、苯甲酸等。铜绿假单胞菌NY3经过一系列氧化代谢将菲转化为1-羟基-2-萘甲酸,进一步反应生成α-萘酚。由菲到1-羟基-2-萘甲酸,未检测到其他产物,说明该阶段产物被继续代谢的速度快,产物含量低不易积累。1-羟基-2-萘甲酸为体系中积累的唯一的主要代谢产物。尽管继续代谢速度慢,但它可以按照α-萘酚、邻羟基苯基羰基乙酸、水杨酸、苯甲酸途径被继续转化。NY3降解菲的代谢产物中未检测到二羟基萘、苯二酚等多羟基化合物,但羟基和羧基处于邻位的化合物,如1-羟基-2-萘甲酸和水杨酸有非常明显积累的趋势,α-萘酚和苯甲酸积累速度次之。

铜绿假单胞菌胞外液对菲的降解特性研究

以铜绿假单胞菌NY3为受试菌株,通过检测降解率、中间产物、可生化性及降解过程中自由基等指标,研究了铜绿假单胞菌胞外液对菲的降解特性及机理。结果表明,NY3菌胞外液具有一定的菲降解能力,72 h内降解率可达46.13%。通过中间产物鉴定结果可知,NY3菌胞外液可将含3个苯环的菲逐步降解为邻苯二甲酸酯、苯基乳酸、戊二酸等苯环减少或者无苯环的中间产物,表明该降解是一个逐步氧化的过程。这种胞外液对菲的初步降解,提高了菲的可生化性,可促进NY3菌细胞对其进一步代谢。对降解机理的初步探索发现,NY3菌胞外液中的吩嗪类物质,可通过自由基途径参与菲的降解。综合上述结果可知,铜绿假单胞菌胞外液可通过吩嗪类物质参与的自由基途径降解胞外液中的部分菲,增加胞外液中菲的可生化性,从而加速菲的生物降解过程。该研究结果可为全面了解铜绿假单胞菌降解污染物的路径及机理提供理论指导。