海水浸泡开放性颅脑外伤早期水通道蛋白4和Na＋-K＋-2Cl-协同转运蛋白1表达的改变

目的了解海水浸泡开放性颅脑外伤早期水通道蛋白4（AQP4）和Na＋-K＋-2Cl-协同转运蛋白1（NKCCl）的表达，及其与脑水肿和血脑屏障破坏程度的关系。方法选取102只sD大鼠，采用控制性皮质撞击法造成不同程度的脑外伤，致伤后将局部损伤的脑组织浸泡在人工海水或生理盐水中，构建动物模型。采用随机数字表法将大鼠分为海水浸泡组和生理盐水浸泡组，每组51只。另选取17只大鼠作为对照组。观察各组在浸泡后3、8和24h时间点上病理学、脑含水量、血脑屏障开放程度、AQP4蛋白和NKCCl表达水平。结果与生理盐水浸泡组相比较，海水浸泡组AQP4表达水平在浸泡后3h（0．222±0．018）和8h（0．228±0．01S）显著降低，而浸泡后24h（0．462±0．013）表达水平显著升高，并超越生理盐水浸泡组；海水浸泡组NKCCl表达水平24h（0．050±0．012）内均处于明显降低的水平。结论海水浸泡对血脑屏障产生明显破坏，导致海水浸泡开放性颅脑外伤具有脑水肿发生晚但程度重的特点。海水浸泡后AQP4表达水平具有先抑制后促进的特点，其与脑组织含水量有类似的变化，值得进一步研究。

布美他尼后处理对大鼠创伤性颅脑损伤后NKCC1表达及脑含水量的影响

目的探讨布美他尼后处理对大鼠创伤性颅脑损伤后Na＋-K＋-2Cl-协同转运蛋白1（NKCC1）表达及脑含水量的影响。方法雄性SD成年大鼠90只,体重220-300 g。采用随机数字表法,将大鼠分为3组：假手术组（S组）、脑创伤组（TBI组）和布美他尼后处理组（TBI-B组）。采用自由落体撞击法制备创伤性颅脑损伤模型。S组接受同样的操作但不接受撞击,TBI-B组于创伤后30 min给予布美他尼30 mg/kg,TBI组给予等量的生理盐水。TBI组和TBI-B组在创伤后12 h测动脉压并取动脉血行血气分析,于创伤后2、12、24 h处死大鼠并取脑,测定皮质NKCC1的表达和脑含水量。结果与S组比较,TBI组和TBI-B组NKCC1表达水平和脑含水量在创伤后12、24 h升高（P〈0.05,P〈0.01）;与TBI组比较,TBI-B组NKCC1表达和脑含水量在创伤后12 h、24 h降低（P〈0.05,P〈0.01）。结论布美他尼后处理可减轻成年大鼠创伤性脑损伤,其机制可能与布美他尼减少大鼠脑组织NKCC1表达有关。

NKCC1、KCC2及mTOR相关蛋白4E-BP1在外伤性癫痫中的表达及意义

目的探讨主要表达于神经元细胞膜上的NA^+-K^+-2CL-转运体(NKCC1)、K^+-CL-转运体(KCC2)及表达于神经元细胞质中m TOR通路信号蛋白4E结合蛋白1(4E-BP1)在外伤性癫痫(PTE)癫痫灶中的表达及临床意义。方法收集2010年1月至2015年12月福建医科大学附属第一医院神经外科外伤性癫痫患者术后脑组织标本14例作为实验组;选取脑外伤患者行减压或清创手术获取的和各种病变患者手术入路不可避免要切除的正常脑组织8例作为对照组。用Western blot和实时定量荧光PCR(RT-PCR)检测14例PTE癫痫脑组织、8例对照组"正常脑组织"NKCC1、KCC2、4E-BP1的表达。结果 Western blot显示PTE病灶脑组织中4E-BP1、NKCC1相对灰度值(0.61±0.12、0.92±0.19)高于正常脑组织(0.27±0.05、0.67±0.66),差异有统计学意义(P<0.05)。PTE病灶脑组织中KCC2相对灰度值(0.58±0.99)低于正常脑组织(0.72±0.06),差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示,PTE病灶脑组织中4E-BP1、NKCC1相对灰度值(30.84±1.32、27.81±1.92)高于正常脑组织(26.94±1.24、23.52±0.74),差异有统计学意义(P<0.05)。PTE病灶脑组织中KCC2相对灰度值(21.55±1.01)低于正常脑组织(24.59±1.02),差异有统计学意义(P<0.05)。PTE组中NKCC1/KCC2比值(1.29±0.11)高于对照组(0.96±0.26),差异有统计学意义(P<0.05)。结论NKCC1、KCC2和m TOR通路信号蛋白4E-BP1的异常改变,可能是外伤后脑组织组织学改变及反复癫痫发作的重要分子机制。

脑水肿治疗新见解

缺血性脑卒中、脑外伤、脑血管破裂及脑瘤患者常有脑水肿。虽然脑水肿的原因多种多样,但水肿的病理生理过程却有相似的分子机制。坚硬的颅骨固定了颅腔容积,脑水肿引起的继发性神经元损伤的后果常常十分棘手。随着细胞内、外容积的变化,脑水肿必然影响局部或全脑的血液循环和代谢,甚至产生致命的脑组织挤压。脑水肿常规的治疗不外乎皮质醇、利尿剂、脑代谢抑制剂和渗透疗法,而渗透疗法仍然是最有效的治疗方法之一,且在临床广泛应用。新近发现Na+-K+-2Cl-转运体1和磺脲类受体1调控、三磷腺苷敏感的非选择性阳离子通道(如磺脲类受体1-瞬时受体电位M4通道)是脑水肿治疗的新靶点。目前已经证明这2个与离子转运有关的蛋白质在损伤引起的脑水肿中起着关键作用,特异性地抑制它们可明显减缓脑水肿的发生。另一类有应用前景的治疗脑水肿药物是血管升压素受体拮抗剂。很多导致脑水肿的神经疾病常出现正常容量性低钠血症,血管升压素V1A/V2受体拮抗剂考尼伐坦有促进水排出,保留电解质的利水作用,因此,可用于治疗伴有低钠血症的脑水肿。

离子转运／交换蛋白在缺血性脑卒中后脑水肿中的作用机制

脑卒中严重危害着人类生命健康，目前高居世界人类死因排名第二位、中国居民死亡率第二位，且发病率近年来仍呈上升趋势。脑卒中分为缺血性脑卒中及出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中的发病率更高，约占脑卒中总数的80％。

大黄-黄芩配伍应用对脑损伤早期癫痫易感性的影响

目的：研究大黄-黄芩配伍应用对小鼠脑损伤早期癫痫易感性的影响,探讨该药对抗脑损伤后癫痫的机制。方法：将SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为空白组,模型组,大黄-黄芩药对低（1 g·kg^-1）,高剂量组（4 g·kg^-1）及阳性组（2.6 g·kg^-1丙戊酸钠）。除空白组外,其余各组采用自由落体法建立小鼠封闭性颅脑损伤模型,于脑损伤后给予相应药物灌胃治疗,连续7 d。于末次给药后给予戊四氮（pentylenetetrazole,PTZ）亚惊厥剂量刺激,通过行为学观察各组小鼠的癫痫发作潜伏期及平均发作强度,脑电图（electroencephalogram,EEG）分析小鼠的脑部放电图谱,统计0-20 Hz的放电总和;免疫组化法（immunohistochemistry,IHC）计数海马CA1,CA3区胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的阳性细胞数;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测神经元Na^＋-K^＋-2Cl^-共转运体-1（NKCC1）的蛋白表达水平。结果：与空白组比较,模型组的小鼠癫痫发作潜伏期明显缩短,脑部异常高频放电明显增多,海马CA1,CA3区的GFAP阳性细胞计数显著增加（P〈0.05）,且神经元NKCC1的表达也较高（P〈0.05）;与模型组比较,药对低、高剂量均可延长癫痫发作的潜伏期,减少脑部异常放电,降低海马区GFAP阳性细胞数以及神经元NKCC1蛋白的表达,且药对高剂量组与模型组比较具有显著性差异（P〈0.05）。结论：大黄-黄芩配伍应用可降低脑损伤早期癫痫的易感性,作用机制可能与星形胶质细胞的调控作用有关。

SGLT2选择性抑制剂筛选及药效评价方法建立

本研究的目的是建立SGLT2选择性抑制剂筛选及药效学评价体系。分别将人全长SGLT2和SGLT1c DNA连接至p MSCVpuro载体并转染HEK293细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞,RT-PCR、Western blot或细胞免疫荧光染色检测目的基因、蛋白在细胞中的表达。采用荧光标记的1-脱氧葡萄糖(1-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-1-deoxy-D-glucose,1-NBDG)作为底物进行葡萄糖转运实验,检测模型细胞的Na+依赖的葡萄糖摄取功能,并对阳性药达格列净、根皮苷选择性进行评价。最后,进行整体药效评价,观察达格列净对正常小鼠及四氧嘧啶诱导的T1DM小鼠血糖的影响。结果显示p MSCVpuro-SGLT1转染组细胞SGLT1基因及蛋白水平均显著升高,p MSCVpuro-SGLT2转染组SGLT2蛋白高表达于细胞膜及细胞质,说明SGLT1/SGLT2稳定过表达细胞构建成功。葡萄糖转运实验结果显示,与p MSCVpuro-null转染组相比,p MSCVpuro-SGLT1、p MSCVpuroSGLT2转染组细胞Na^+依赖性1-NBDG摄取明显增高。达格列净具有良好的选择性,对SGLT1的半数抑制浓度(IC50,6.20×10^(-7) mol·L^(-1))远高于对SGLT2抑制的IC50值(2.24×10^(-10) mol·L^(-1)),优于非选择性抑制剂根皮苷。达格列净单次给药即可改善正常小鼠葡萄糖耐量。对T1DM小鼠,达格列净从给药后1 h血糖水平即显著降低,能够剂量依赖地降低0~24 h血糖-时间曲线下面积。连续给药20天,能够较平稳地降低小鼠餐后血糖。本研究建立了较完善的SGLT2选择性抑制剂的体外筛选方法和整体药效学评价方法。该方法具有无同位素污染,高转运效率、良好稳定性等优点,将为新的SGLT2高选择性抑制剂研发提供良好的技术平台。