脑脊液中Na^(+)-K^(+)-Cl^(-)协同转运蛋白1启动子甲基化对重型颅脑损伤患者预后有评估价值

目的:探讨重型颅脑损伤(sTBI)患者脑脊液中Na^(+)-K^(+)-Cl^(-)协同转运蛋白1(NKCC1)基因启动子甲基化的临床意义。方法:招募92例sTBI患者,根据格拉斯哥预后量表(GOS)将患者分为预后良好组(GOS>3分)63例与预后不良组(GOS≤3分)29例,选取同一时间段行腰椎内固定术后脑脊液漏的51例患者作为对照组。收集2组脑脊液样本,采用亚硫酸氢盐测序法(BSP)测定NKCC1启动子区域CpG位点的甲基化状态。采用Logistic回归分析影响sTBI患者预后的风险因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估启动子甲基化的预测价值。采用定量反转录聚合酶链式反应法检测NKCC1在sTBI患者脑脊液中mRNA的表达水平。采用Pearson相关系数对启动子甲基化水平与其mRNA表达水平进行相关性分析。结果:预后不良组患者NKCC1的CpG_30.31、CpG_39.40.41位点的甲基化水平低于预后良好组(P均<0.05)。Logistic回归分析显示CpG_30.31、CpG_39.40.41位点甲基化水平是影响sTBI患者预后的独立风险因素(P均<0.05)。ROC曲线分析结果显示CpG_30.31、CpG_39.40.41位点甲基化水平预测sTBI患者预后的曲线下面积(AUC)为0.7085、0.7315(P=0.0014,0.0004)。NKCC1的CpG_30.31、CpG_39.40.41位点甲基化水平与NKCC1的mRNA水平呈负相关(r=-0.2574、-0.1328,P=0.0138、0.0325)。结论:NKCC1启动子甲基化状态对评估sTBI患者预后有价值。

基于水协同转运蛋白KCC1、KCC3、KCC4、NKCC1含量及Na^+ -K^+ -ATP酶活性变化研究湿阻中焦证的水液代谢机制

目的：以前期研究的水通道蛋白为平台,通过观察并分析水协同转运蛋白KCC1、KCC3、KCC4、NKCC1含量及Na~＋-K~＋-ATP酶活性变化,揭示湿阻中焦致水液代谢紊乱及平胃散对其修复作用机制的科学内涵,为中医临床治疗本证型疾病提供实验参考;同时搭建中药复方水通道调节剂的研究平台。方法：模拟＂外湿过盛,困阻脾胃、饮食不节,湿从内生、情志不遂,气机受阻、水湿不运三大致湿病因,建立湿阻中焦证模型。用蛋白定量法测定Na~＋-K~＋-ATP酶活性,用酶联免疫法（ELISA）测定肾脏组织KCC1,KCC3,KCC4,NKCC1的含量。结果：与空白组比较,模型组肾脏KCC1、KCC4含量升高,KCC3、NKCC1、Na~＋-K~＋-ATP酶活力降低,与模型组比较,自然恢复组肾脏KCC1、KCC3、NKCC1含量降低,Na~＋-K~＋-ATP酶活力明显升高（P〈0.01）,KCC4含量有上升趋势,经药物干预后,各给药组KCC1含量均明显降低（P〈0.01）,平胃散中剂量组KCC3、KCC4含量明显升高（P〈0.01）,平胃散低剂量组NKCC1含量明显降低（P〈0.01）;平胃散低剂量组肾脏Na~＋-K~＋-ATP酶活力明显升高（P〈0.01）;呋塞米组和平胃散加泽泻组KCC1、KCC3、KCC4、NKCC1含量及Na~＋-K~＋-ATP酶活性均明显降低,差异有统计学意义（P〈0.01）;与自然恢复组比较,平胃散中剂量组肾脏KCC1、KCC3、KCC4含量及Na~＋-K~＋-ATP酶活力有上升趋势,平胃散低剂量组NKCC1含量下降明显（P〈0.01）,呋塞米组和平胃散加泽泻组KCC1、KCC3、KCC4、NKCC1含量及Na~＋-K~＋-ATP酶活性均明显降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：（1）湿阻中焦证模型不仅能够影响体内能量代谢,还能够影响KCC1、KCC3、KCC4、NKCC1含量表达,这可能是湿阻中焦导致水代谢输布障碍的机制之一;（2）平胃散能够调整Na~＋-K~＋-ATP酶活性和KCC1、KCC3、KCC4、NKCC1含量分布参与能量代谢和水液代谢调控,这可能是平胃散燥湿运脾、行气导滞、散中焦之湿阻治疗湿阻中焦证的分子机理之一;（3）水协同转运蛋白之间可能存在互补代偿机制。

生姜对缺血性脑水肿大鼠脑组织Na^+-K^+-2Cl^-联合转运蛋白1型的影响

目的:研究生姜对缺血性脑水肿大鼠脑组织Na^+-K^+-2Cl^-联合转运蛋白1型(Na^+-K^+-2Cl^- combined transporter type 1,NKCC1)表达水平的影响。方法:将雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型对照组,生姜高、中、低剂量组。通过线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型。各组在造模前、后均给药5d。生姜高、中、低剂量组依次给予生姜10,20,40μL/g,假手术组、模型对照组给予等容积生理盐水10μL/g,灌胃给药,1d1次,连续给药10d。进行神经功能评分,通过病理组织学检查大脑病变情况,干湿重法测大脑含水量,免疫荧光染色法和Western-Blot法研究NKCC1的表达水平。结果:与假手术组对比,模型对照组大鼠出现明显的神经功能障碍,脑组织出现明显梗死灶,脑组织含水量明显升高,NKCC1蛋白表达水平升高(P<0.01)。与模型对照组对比,生姜高、中剂量组神经功能评分降低,脑梗死面积缩小,脑组织含水量降低,NKCC1蛋白的表达降低(P<0.05)。结论:生姜可能通过降低NKCC1水平,对缺血性脑水肿大鼠产生保护作用。

常压氧对大鼠脑缺血再灌注损伤Na^+-K^+-2Cl^-共转运蛋白1型的影响

目的:研究常压氧(NBO)对大鼠脑缺血再灌注损伤Na^+-K^+-2Cl^-共转运蛋白1型(NKCC1)的影响。方法:采用线栓法构建大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO),术后2h进行神经功能评分,将其评分与假手术组进行比较。MCAO模型构建成功者进行再灌注,随机分为NBO组和模型组,NBO组于再灌注后采用体积分数60%NBO进行治疗。各组大鼠分别在0、2、4、6、12和24h处死,取脑组织进行HE染色及Western Blot检测。结果:与假手术组相比,MCAO组神经功能评分显著增高,差异有显著性意义(P<0.05)。HE染色结果显示模型组和NBO组大鼠缺血2h时脑组织均无明显病理结构改变,随着再灌注时间的延长,模型组大鼠脑组织病理改变逐渐增加,而与模型组相比,NBO组大鼠的脑组织病理改变明显减轻。Western Blot检测结果显示模型组和NBO组在起始2h内,脑组织NKCC1蛋白和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达水平与正常脑组织相比没有明显变化(P>0.05),随着再灌注时间的延长,模型组NKCC1蛋白和HIF-1α蛋白表达水平明显增加,NBO组NKCC1蛋白和HIF-1α蛋白表达水平虽有增加但其表达水平仍明显低于模型组(P<0.05)。结论:NBO疗法可以下调脑缺血再灌注后脑组织NKCC1蛋白和HIF-1α蛋白的表达,减轻大鼠脑缺血再灌注损伤,促进大鼠神经功能恢复,具有脑损伤保护作用。