杨树Na^+/H^+反向运输蛋白基因(PtNHX_1、PtNHX_6)的克隆和检测

Na+/H+反向运输蛋白基因(NHX)是在细菌、植物和动物体内普遍存在的一类膜蛋白基因家族。迄今已在模式植物拟南芥中分离出AtNHX1、AtNHX2、AtNHX3、AtNHX4、AtNHX5和AtNHX6共6个成员,并发现部分成员对盐胁迫有不同程度的响应。以AtNHX1和AtNHX6的cDNA核苷酸序列为信息探针,基于可利用的杨树EST数据库和毛果杨全基因组测序结果,通过电子杂交辅助的克隆技术,从毛白杨形成层cDNA中分离得到长度分别为1635bp和1709bp的2个cDNA,其分别含有编码544个和526个氨基酸残基的完整开放阅读框。由它们所推导的蛋白质序列与拟南芥、水稻、小麦和玉米的NHX1和NHX6基因的蛋白质序列高度同源,同源性分别为79%、76%、69%和74%以及82%、82%、27%和26%,故将其命名为PtNHX1和PtNHX6(GenBank注册号分别为AY660749和AY832912)。Southern杂交分析表明,PtNHX1和PtNHX6均为低拷贝基因(或有一些高度同源的基因),在杨树基因组中以1～4个拷贝形式存在。组织特异性RT-PCR结果显示,PtNHX1和PtNHX6基因在杨树根、茎和叶片中均有表达,但其表达模式稍有不同:PtNHX1在根部、形成层、未成熟木质部、成熟叶和嫩叶中均高度表达,在韧皮部和成熟木质部中有少量表达,而PtNHX6在根部、成熟叶和嫩叶中表达丰度较高,在韧皮部、形成层、未成熟木质部表达丰度较低,在成熟木质部中表达丰度极低。NaCl诱导的杨树叶片差异表达RT-PCR检测结果初步表明,PtNHX1和PtNHX6基因均受盐诱导表达,当溶液中NaCl浓度在100～400mmol.L-1内,随着盐浓度的提高,PtNHX1和PtNHX6基因的表达丰度逐渐增强,但超过400mmol.L-1后,其表达丰度均有所降低,这与所测定的叶片ABA含量匹配。

北美海蓬子Na^+/H^+逆向运输蛋白基因的克隆及拟南芥转化分析

Na+/H+逆向运输蛋白在植物耐盐性方面起着极为重要的作用。根据在不同植物中功能相同的同源基因保守序列设计引物,通过RT-PCR方法从真盐生植物北美海蓬子(Salicornia Bigelovii Torr.)中克隆出包括有1683bp的完整编码区在内的2591bp(GenBank登陆号为DQ157454)的Na+/H+逆向运输蛋白基因(SbNHX1)cDNA序列。将该基因编码区序列构建到植物表达载体pVKH-35S-pA上,并通过农杆菌介导转化到模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,得到T3代转入单基因种子。200mmol/L的NaCl胁迫培养结果显示,转基因拟南芥在200mmol/L的NaCl胁迫条件下生长状况好于野生型植株,植物表现有一定的耐盐性。

胡杨Na^+/H^+反向运输载体(PeNHX2)基因的克隆与序列分析

植物液泡膜上Na+/H+反向运输载体(Na+/H+antiporterNHX)已被证明在盐胁迫中发挥关键作用,该研究旨在从胡杨中克隆获得耐盐相关的的完整cDNA序列,为进一步比较胡杨的耐盐基因的差异,探讨胡杨的耐盐分子机理奠定了基础,并为通过转基因手段提高木本植物的耐盐能力提供侯选基因。根据已发表NHX的同源基因序列,采用特异性引物扩增核心片段,并结合5’与3’RACE技术,成功地从胡杨(populus euphratica)克隆获得PeNHX2,其cDNA全长1638bp。测序和序列分析结果表明该基因与已发表毛白杨(Populus tomentosa)PtNHX基因在核酸水平及蛋白质水平上同源性均达到最高,依次为90.6%和88.25%。利用DNAMAN软件进一步分析得知,该基因与新疆盐生植物中所克隆获得的的犁苞滨藜(Atriplex dimorphostegia)AdNHX1、灰绿藜(Chenopodium glaucum)CgNHX1、盐爪爪(Kalidium foliatum)KfNHX同源性也较高,核酸水平上依次为75.1%、74.8%、74.3%,蛋白质水平依次为78.3%、79.0%、78.3%。PeNHX2与NCBI已注册的部分PeNHX1序列,在核酸或蛋白质水平同源性(72.34%和73.72%)均较低,分析它们可能同属于胡杨NHX基因家族,相关生物学功能有待于进一步研究。

植物Na^+,K^+/H^+反向转运体:pH平衡与囊泡运输

细胞内pH和囊泡运输是影响细胞功能的重要影响因子,也是决定细胞是否死亡的重要因素。植物Na^+,K^+/H^+反向转运体是位于细胞膜结构上的跨膜反向转运蛋白,介导Na^+、K^+与质子(H^+)的跨膜反向转运,影响胞内pH的动态平衡。研究表明,NHX缺失造成细胞pH失衡的同时,将影响囊泡运输,从而对生长发育产生不利影响。主要对植物NHX在pH调节、囊泡运输中的功能进展进行了概述,并对其关系进行探讨。

花花柴Na^+/H^+反向运输载体的表达和抗血清制备

文章建立了检测耐盐植物功能基因抗体制备和蛋白表达的方法。

大肠杆菌Top10Na^+/H^+反向运输体A基因的克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的Na+/H+反向运输体(Na+/H+antiporterA,nhaA)的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌(Escherichia coli)Top10中克隆到了nhaA基因(Acession Numeber:EU368045)。nhaA开放阅读框为1 167 bp,编码含有388个氨基酸残基,分子量为41.3 kDa的蛋白,预测等电点为9.23。nhaA含有25个碱性氨基酸,19个酸性氨基酸,211个疏水氨基酸及63个极性氨基酸。二级结构预测表明,该蛋白含约50%的α-螺旋、18%的延伸链、7%的β-转角和25%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,nhaA是疏水性蛋白。跨膜结构进行分析显示该蛋白含有11个跨膜区域。序列分析表明,大肠杆菌Top10 nhaA基因与大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HS、大肠杆菌SECEC SMS-3-5和大肠杆菌CFT073的nhaA基因同源性分别为100%、98%、95%和92%。大肠杆菌Top10 nhaA基因的克隆及生物信息学分析为今后对nhaA的进一步深入研究奠定了基础。

木榄细胞膜Na^+/H^+逆向运输蛋白BgSOS1功能的初步验证

根据木榄BgSOS1的序列信息从木榄中克隆到了全长的BgSOS1基因,该片段包含1个3 462 bp的开放阅读框,可编码1 153个氨基酸的多肽.生物信息学的分析结果表明:该氨基酸序列所编码的蛋白与拟南芥、番茄、水稻、小麦、盐芥和杨树的SOS1蛋白高度同源,同源性分别为63.86%,66.61%,62.18%,60.19%,63.97%和75.97%;BgSOS1蛋白的N端含有12个跨膜的结构域,C端为1个较长的胞内结构域.尽管单个BgSOS1的表达并不能提高转基因酵母的抗盐性,但SOS1,SOS2和SOS3共表达的酵母,其抗盐性明显提高,这表明SOS2/SOS3蛋白激酶复合体可能通过调控BgSOS1的Na+/H+交换功能来提高木榄的抗盐机理.

欧洲山杨液泡膜Na^+/H^+反向运输体的性质鉴定

植物液泡膜Na+/H+反向运输体可将细胞质中的Na+转运到液泡内储存,以减少胞内Na+的毒性.但木本植物如杨树是否有同样的机制目前还不清楚.以欧洲山杨的愈伤组织为材料,捣碎破碎愈伤组织细胞,经过差速离心和不连续蔗糖梯度离心得到纯化的欧洲山杨液泡微囊.通过液泡V-ATPase建立质子梯度,该液泡能够利用此梯度调控Na+的转运,表明液泡膜上存在Na+/H+反向运输体活性(表观米氏常数Km是11.4mmol/L).Na+/H+反向运输体的抑制剂——氨氯吡嗪咪能明显抑制转运体的活性.该Na+/H+反向运输体也可以转运K+,但亲和能力比Na+低30%.该结果首次证明木本植物的液泡膜上存在Na+/H+反向运输体.初步功能研究表明,愈伤组织在盐胁迫条件下,Na+/H+反向运输体活性明显下降,提示该机制可能与山杨不耐盐有关.

植物胞内Na^+/H^+逆向转运蛋白研究进展

该文就植物中Na+/H+逆向转运蛋白的发现、特征、分子生物学方面的研究,以及植物体细胞内Na+/H+逆向转运蛋白,在植物细胞的体内平衡及胁迫忍耐等方面的研究进行了综述。

苦豆子液泡膜Na^＋／H^＋逆向运输蛋白基因SaNHX1的克隆与生物信息学分析

苦豆子(Sophora alopecuroides L.)因其具有很强的耐盐、耐旱、耐高温等功能广泛分布于干旱荒漠区。研究报道植物液泡膜Na^+/H^+逆向运输蛋白对植株耐盐性及耐旱性等具有重要作用。本研究首先对苦豆子种子进行萌发处理,采用改良的异硫氰酸胍法提取苦豆子的总RNA,利用逆转录试剂盒获得苦豆子的cDNA,通过同源克隆法获得了苦豆子液泡膜Na^+/H^+逆向运输蛋白基因的cDNA全长,并对其氨基酸序列及可能的功能进行了生物信息学分析。结果显示,所获得的基因编码548个氨基酸,与豆科植物大豆GlNHX1的一致性最高为86%;二级结构预测显示其具有10个跨膜结构,不含信号肽;对其3D结构预测显示该蛋白是一个富含α螺旋的桶装蛋白质。这些预测结果表明本研究所克隆的基因为苦豆子液泡膜逆向运输蛋白Na^+/H^+基因,这将为荒漠植物苦豆子抗逆基因资源的发掘利用奠定基础。

硅促进盐胁迫下黄瓜NHX1基因表达及Na^+在液泡中的区隔化效应

【目的】硅可提高植物的耐盐性,但不同植物中硅提高耐盐性的机理并不相同。探究硅对盐胁迫下黄瓜幼苗的氧化损伤、Na^+积累和激素水平的影响,以阐明硅提高黄瓜耐盐性的机制。【方法】以基因型为Mch-4的黄瓜幼苗为试材,进行水培试验。营养液中NaCl的胁迫浓度为65 mmol/L,施硅水平为Na2SiO3·9H2O0.3 mmol/L。在处理10天后,测定黄瓜幼苗生物量、Na^+含量与分配、Na^+转运相关基因表达水平及激素含量。【结果】施硅可改善盐胁迫下黄瓜幼苗的生长,减轻植株的氧化损伤。硅对盐胁迫下黄瓜根系和叶片Na^+含量无明显影响,可显著降低根和叶中质膜Na^+/H^+反向转运蛋白基因SOS1的表达量,对高亲和力钾转运蛋白基因HKT1的表达均影响不大,但促进了液泡膜Na^+/H^+反向转运蛋白基因NHX1的表达。对盐胁迫下黄瓜叶片Na^+的亚细胞定位发现,硅处理使叶绿体中Na^+含量下降,而液泡中Na^+含量升高。硅处理提高了盐胁迫植株根和叶片中赤霉素、生长素和细胞分裂素的水平。【结论】施硅可提高液泡膜Na^+/H^+反向转运蛋白基因NHX1的表达,将Na^+区隔化于液泡中,进而降低叶绿体中的Na^+含量,缓解盐胁迫下黄瓜幼苗的氧化损伤;硅还诱导产生了较多的赤霉素、生长素和细胞分裂素,其调控Na^+积累和黄瓜幼苗的氧化损伤的机理还需进一步研究。

AtNHX1基因对荞麦的遗传转化及抗盐再生植株的获得

通过农杆菌介导法将拟南芥液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因AtNHX1转入荞麦中,在2·0mg/L6-BA、0·1mg/LIAA、1mg/LKT、50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行选择培养,从来源于864块外植体的36块抗性愈伤组织中共获得426棵再生植株(转化频率为4·17%)。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR和Northern检测,初步证实AtNHX1基因已整合至荞麦基因组中。用200mmol/L的盐水对转基因植株和对照植株进行胁迫处理6周,转基因植株能够生存,而对照植株死亡。用不同浓度的NaCl溶液处理转基因植株和对照植株,发现Na+及脯氨酸含量在转基因植株中的积累水平显著高于对照植株,而K+的含量在转基因植株中的积累水平低于对照植株。次生代谢产物黄酮类化合物芦丁在转基因植株根、茎和叶片中的含量也比对照植株明显要高。这些结果表明利用基因工程手段提高作物的耐盐性是可行的。

盐桦BhNHX的克隆及其与CaM在胁迫下的协同表达(英文)

以盐桦组培苗为材料,通过RACE技术克隆了液泡膜Na+/H+反向运输体基因BhNHX,采用DNAman软件和BLASTN对cDNA序列进行分析并与其他植物的NHX基因进行同源性比较,最后对BhNHX和钙调蛋白基因(CaM)在各种胁迫条件下的协同表达进行半定量的RT-PCR分析.结果显示:(1)获得了BhNHX的全长cDNA序列,包含1 623 bp的开放阅读框架,编码一个540个氨基酸的多肽,有11个推测跨膜区,与已报道的液泡膜Na+/H+反向运输载体蛋白跨膜区数目一致;(2)BhNHX的核酸序列与其他植物NHX具有较高同源性,与葡萄NHX序列一致性达到76%;(3)BhNHX和钙调蛋白基因CaM可同时被盐、低温、干旱所诱导;但ABA只能较明显诱导BhNHX的表达,而对CaM的诱导表达不明显.研究表明,在盐桦受到盐、低温及干旱胁迫时BhNHX和CaM可能协同表达,而在ABA诱导时两者可能具有不同的表达调控模式.

利用RNAi技术抑制拟南芥NHX1基因家族的表达

采用RNAi抑制NHX1基因家族的表达,并观察其对拟南芥耐盐性和耐旱性的影响.根据从拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)cDNA中扩增出编码Na+/H+反向转运蛋白基因AtNHX1长度为210 bp高度保守序列作为RNAi的靶标区,并正反2个方向插入载体pHANNIBAL中,2个片段用intron连接;将RNAi表达框连入具有NPTⅡ筛选标记基因的表达载体pART27中,构建以拟南芥NHX1基因家族为靶标的RNAi载体.采用农杆菌介导的真空渗透法转化拟南芥,得到T0代转基因拟南芥种子.对转基因阳性植株进行RT-PCR检测以及耐盐性和耐旱性分析.结果表明,利用本实验构建的NHX1基因家族RNAi载体,拟南芥NHX1基因家族表达被成功地抑制;耐盐和耐旱分析表明RNAi技术对基因表达沉默是有效的.

OsCHX1基因克隆及转基因植株获得

利用RT-PCR扩增水稻的Na+、K+/H+反向转运蛋白(OsCHX1)基因全序列,将其与35S启动子连接后,插入到p1301中,构建植物过量表达载体p1301-35S-OsCHX1-NOS.将该质粒转化农杆菌EHA105,并对水稻愈伤组织进行转化,获得了再生植株.对再生植株进行GUS和PCR鉴定,发现超过85%的再生植株为阳性植株.此研究结果为进一步探讨OsCHX1基因功能提供了实验材料.