日粮中添加Na和N1型纳豆枯草芽孢杆菌培养物对犊牛瘤胃发育的影响

试验研究了Na和N1型纳豆枯草芽孢杆菌培养物对犊牛瘤胃乳头发育的影响。24头荷斯坦公犊牛(7d±1.1d)随机分为3个处理组,每组8头。断奶前Na型和N1型纳豆菌培养液与牛奶混合,断奶后纳豆菌培养液与犊牛精料混合饲喂。当犊牛开食料采食量达到20g/kg体重时断奶。断奶后每组随机选取4头犊牛屠宰,余下的犊牛继续饲喂,44d后屠宰。采集犊牛瘤胃液和瘤胃组织样品。结果表明,饲喂Na和N1型纳豆枯草芽孢杆菌降低了断奶时和断奶44d犊牛瘤胃液中短链脂肪酸浓度(P<0.05),N1型纳豆枯草芽孢杆菌降低了瘤胃pH及丁酸的摩尔百分比(P<0.05)。Na型纳豆枯草芽孢杆菌降低了断奶犊牛瘤胃中乙酸的摩尔百分比,同时降低游离氨水平(P<0.05),且可以降低断奶后44d犊牛瘤胃中NH3浓度(P<0.05)。与对照组相比,饲喂Na型和N1型纳豆枯草芽孢杆菌可提高断奶时和断奶后44d单位面积瘤胃壁乳头的数目和表面积(P<0.05)。而且,饲喂纳豆菌后犊牛瘤胃乳头表面平滑,呈舌型,无细颈,团块和角质化不全现象。因此,饲喂纳豆枯草芽孢杆菌可促进犊牛瘤胃发育。

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

以纳豆芽孢杆菌HL-1全基因组DNA为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽及成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-NK),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因序列(pro-NK)和只编码成熟肽的纳豆激酶基因序列(NK),构建了大肠杆菌表达质粒pET28a-NK表达前纳豆激酶原基因及大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pHT315-NK表达纳豆激酶原基因和纳豆激酶基因,实现了纳豆激酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达,并进行了活性分析。

纳豆枯草芽孢杆菌对犊牛断奶前后瘤胃发酵和酶活的影响

本试验旨在研究纳豆枯草芽孢杆菌在犊牛瘤胃中可能的作用机理。选取24头7日龄左右中国荷斯坦奶牛公犊牛,分为试验1、2组及对照组。试验1、2组犊牛直接饲喂N1型和Na型纳豆枯草芽孢杆菌菌液,对照组不饲喂菌液,当各组犊牛开食料采食量达到规定要求时断奶。断奶时每组随机选取4头犊牛屠宰,剩余12头犊牛继续饲喂,8周后屠宰。结果表明:①在断奶时及断奶后8周,试验1组犊牛瘤胃pH显著低于对照组和试验2组(P<0.05);②断奶时及断奶后8周两处理组犊牛瘤胃总挥发性脂肪酸显著低于对照组(P<0.05);断奶早期3组犊牛瘤胃食糜中乙酸的摩尔百分比差异不显著,而断奶后8周试验1组犊牛瘤胃中乙酸的摩尔百分比较对照组低(P<0.05);与对照组相比,断奶时试验组犊牛瘤胃中丙酸的摩尔百分比显著降低(P<0.05),而断奶后8周各组间无显著差异;③断奶早期试验2组犊牛瘤胃中氨氮浓度显著低于对照组(P<0.05),试验1组氨氮浓度较对照组略低,但无显著差异;断奶后8周两处理组犊牛瘤胃中氨氮浓度显著低于对照组(P<0.05);④整个试验期对照组犊牛瘤胃中性蛋白酶活性显著高于两试验组(P<0.05),而外切葡聚糖酶活性显著低于两试验组(P<0.05),各组犊牛瘤胃中β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶活性无显著差异。本试验说明在犊牛生长的不同时期,不同类型纳豆枯草芽孢杆菌的饲喂效果不尽相同。日粮中添加纳豆枯草芽孢杆菌有利于瘤胃的发育,从而促进犊牛生长。

日粮中添加纳豆枯草芽孢杆菌对犊牛消化道发育的影响

本试验旨在研究纳豆枯草芽孢杆菌对犊牛断奶早期和断奶后8周消化道生长发育的影响。选取24头7日龄中国荷斯坦奶牛公犊,随机分为3个处理,每个处理8头犊牛,试验1、2组犊牛分别饲喂Na型和N1型纳豆枯草芽孢杆菌菌液,对照组不饲喂菌液。饲喂的牛奶中添加纳豆枯草芽孢杆菌菌液,连续饲喂直到开食料采食量达到规定要求时断奶;断奶时各组随机选取4头犊牛屠宰,余下4头犊牛继续饲养,8周后屠宰,称胴体重。结果表明,试验1组犊牛断奶早期瘤网胃重量明显高于对照组(P<0.05);试验2组犊牛断奶早期及断奶后8周瘤胃pH显著低于对照组(P<0.05),且与对照组相比,断奶早期皱胃pH显著下降(P<0.05);试验1组犊牛断奶早期及断奶后8周十二指肠长度较对照组相比明显缩短;断奶后8周两处理组犊牛回肠长度显著小于对照组(P<0.05);此外,饲喂纳豆枯草芽孢杆菌还可显著降低犊牛十二指肠和空肠前段食糜的pH(P<0.05)。本试验结果表明,饲喂纳豆枯草芽孢杆菌有利于营养物质消化,促进犊牛生长。

高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌优选及发酵工艺条件优化

以黄豆为主料,添加不同辅料,采用不同处理方式,以产酶活力为指标研究三株枯草芽孢杆菌发酵性能,筛选优势菌株进行固态发酵,确定最优工艺条件。结果表明:在三株受试菌种中BS21076发酵性能最优,活菌数及纳豆激酶活力均较高;最优固态发酵条件为:大豆90℃下烘炒5min,破碎度为四瓣,魔芋精粉添加量3%,接种量为8%,37℃下发酵24h;在此条件下,酶活力可达(3582.48±83.13)U/g,较传统发酵NK活力极显著(p<0.01)提高。

枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质

利用30%～70%饱和度的硫酸铵沉淀,Sephadex G-50凝胶过滤层析对浅盘发酵纳豆激酶进行分离纯化并对其酶学性质进行初步研究。以纤维平板法测定纳豆激酶活力,SDS-PAGE检验纯化效果。结果表明:纯化后纳豆激酶为电泳纯,分子质量约27.518kD,纯化倍数和酶活回收率分别为19和42.1%,纳豆激酶最适温度为50℃,最适宜pH值为8.0。

高纳豆激酶酶活枯草芽孢杆菌的筛选及菌种鉴定

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,对能产生纳豆激酶的菌株进行了分离筛选,得到了具有较高纤溶活性的四株,考虑到发酵后的纳豆感官,我们最终选择编号为4411、465的菌株作为生产用菌种。根据其形态、生理生化特征以及与枯草芽孢杆菌的比较,初步判断这两株菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

犊牛饲用纳豆枯草芽孢杆菌液体培养条件的优化

纳豆枯草芽孢杆菌作为犊牛直接饲用微生物对增强犊牛机体免疫和促进胃肠发育有益,然而以豆类物质为发酵底物的微生物制剂不适用于犊牛。本研究采用纳豆枯草芽孢杆菌液体培养方法,对培养条件的氮源、碳源、接菌量、装液量、转速和温度进行正交试验,结果表明,在葡萄糖1%、蔗糖1%、大豆蛋白胨6%、胰蛋白胨4%、接种量2%、装液量5ml/dl、180r/min、37℃的培养条件下,发酵24h时,660nm吸光度值达到1.1475。而后进行不同装液量试验,结果表明1000ml容器装液量为400ml时,菌体细胞数量达到最高(4.6×1010个/ml)。

四株纳豆枯草芽孢杆菌的分离筛选与鉴定及其对瘤胃发酵的影响

采用酪蛋白平板和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)平板初筛法、菌落形态和16SrRNA序列比对分别从无菌大豆(DD)、接种稻草的大豆(DC)、市售纳豆(ND)以及实验室储存菌株纳豆枯草芽孢杆菌NY-3(NY)中分离、筛选、鉴定出4株产蛋白酶和纤维素酶活性较高的纳豆枯草芽孢杆菌;通过体外批次发酵试验,向日粮底物中添加1.5×1011cfu筛选出的四株菌,取0h和24h的瘤胃液样测定各个发酵参数.结果表明:与对照组相比,添加纳豆枯草芽孢杆菌(DC组、DD组、ND组、NY组)并不影响瘤胃液pH值(P=0.883),但显著提高瘤胃液中NH3-N值(P<0.05)和挥发性脂肪酸(VFA)各成分的浓度(P<0.05);与对照组相比,DC组的乙酸/丙酸差异不显著(P>0.05),但是DD、ND组和NY组均有显著降低(P<0.05).

纳豆枯草芽孢杆菌对老陈醋中阿魏酸的影响

以纳豆枯草芽孢杆菌为研究对象,用于以玉米为原料的老陈醋发酵。结果表明,糖化酒精发酵第3天接种5.0%的纳豆枯草芽孢杆菌种子液,醋酸发酵结束时的醋汁中阿魏酸含量高达59.36 mg/L。纳豆枯草芽孢杆菌分别接种于玉米、麸皮和谷糠浆液,阿魏酸含量随着发酵时间的延长均先显著增大而后缓慢减小,均在24 h时达到最大值,分别为3.729,1.018,0.661 g/L,而谷糠不粉碎时,阿魏酸缓慢增加,至36 h时其含量为0.087 g/L,仅为粉碎谷糠发酵24 h时的13.16%。采用老陈醋传统酿造工艺,接种纳豆枯草芽孢杆菌酿造的老陈醋,阿魏酸含量为32.45 mg/L,是不接种老陈醋的3.7倍、高粱特级老陈醋的近10倍。添加纳豆枯草芽孢杆菌种子液,提高了老陈醋阿魏酸含量,为工业化生产提供了理论基础。

以豆粕粉为氮源的枯草芽孢杆菌液态发酵生产纳豆激酶

枯草芽孢杆菌液态发酵通常采用蛋白胨作为氮源生产纳豆激酶,导致生产成本过高,发酵液中酶活性较低。采用价格低廉的豆粕粉作为氮源不仅大幅度降低了原料成本,而且显著提高了发酵液中的酶活性。在摇瓶实验中优化确定豆粕粉最佳添加量,并在此基础上优化确定了最佳接种量、发酵液初始p H、发酵时间。最终摇瓶发酵液中酶活达到5 471 IU/m L,是等量胰蛋白胨作为氮源发酵的3.6倍。上述摇瓶发酵参数进一步在7 L发酵罐和200 L中试水平发酵罐进行验证,并优化确定发酵过程中控制溶氧水平为30%,纳豆激酶活性分别达到6 717 IU/m L和4 236 IU/m L。

植物内生枯草芽孢杆菌纳豆激酶同源基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

利用基因组学和生物信息学的方法,从一种植物内生枯草芽孢杆菌菌株Bs0922的基因组DNA中克隆了纳豆激酶的同源基因NK-Bs0922,长度为1 149 bp。通过重组和转化在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了一个大小为48.0 kD的重组蛋白。

低嘌呤、高纳豆激酶活性枯草芽孢杆菌SH21筛选及发酵条件优化

采用酪蛋白平板初筛-摇瓶复筛的方法,从自然发酵大酱中筛选获得1株高产纳豆激酶(nattokinase,NK)的菌株SH21,经16S rRNA基因序列鉴定其为枯草芽孢杆菌。以NK酶活力及嘌呤含量为指标,通过单因素试验和响应面法优化枯草芽孢杆菌SH21液体发酵条件。在单因素试验的基础上,得出碳源、氮源、pH、接种量、发酵温度、发酵时间对菌株发酵液中NK酶活力和嘌呤含量的影响。采用Plackett-Burman设计筛选得到pH、接种量和发酵温度3个显著因素,结合Box-Behnken设计中心组合试验并进行响应面分析。优化后的发酵条件为pH 6.0,接种量3%,发酵温度38℃,在此条件下,NK酶活力由166.99 U/mL提升到204.52 U/mL,提高了1.22倍,嘌呤含量由75.4 mg/L降低到51.27 mg/L,降低了32%。该研究为进一步开发高NK酶活性、低嘌呤产量的枯草芽孢杆菌发酵产品奠定了研究基础。

来源于豆豉的枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的稳定性研究

以中国豆豉中筛选到的1株纤溶酶高产菌株——枯草芽孢杆菌MX-6为研究对象,应用聚合酶链式反应(PCR)成功扩增到1473bp的纤溶酶编码基因aprN,系统进化树结果显示该纤溶酶为纳豆激酶。研究了纳豆激酶对热、pH、金属离子、化学物质、抑制剂和变性剂的稳定性及传代稳定性。结果表明:纳豆激酶在-20,4,30~50℃的热稳定性较好,pH在3~11之间酶活性相对稳定,Mg2+、Ca2+对纳豆激酶具有显著的激活作用,K+、Fe2+对纳豆激酶的稳定性基本无影响,而Mn2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+有显著的抑制作用,Hg2+导致纳豆激酶完全失活,牛血清蛋白、明胶、蛋白胨能够显著提高纳豆激酶的稳定性,丙二醇、海藻酸钠对纳豆激酶的稳定性基本无影响,而乙醇显著降低纳豆激酶的稳定性。PMSF导致纳豆激酶的活性完全丧失,EDAT和DTT对纳豆激酶的活性基本无影响,10mmol/L的SDS显著降低纳豆激酶的稳定性,说明此纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶,不是金属酶,不含二硫键,且具有良好的传代稳定性。结果显示该酶的稳定性较好,具有开发为溶栓药物的应用价值,有利于纳豆激酶的工业化应用。

响应面法优化枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶发酵条件

以分离于纳豆中的枯草芽孢杆菌MX-6为研究对象,通过单因素试验确定温度、初始pH值、接种量、装液量及摇床转数对纳豆激酶活力的影响,应用响应面法的Box-Behnken设计对纳豆激酶发酵条件进行优化。当温度36.69℃、初始pH 6.94、接种量3.03%、装液量48.77 mL、摇床转速170.05 r/min时可获得最大的纳豆激酶溶圈直径20.71 mm,与优化前的溶圈直径相比提高35.54%,表明该模型能科学地预测纳豆激酶的合成情况。结果显示响应面法可有效、成功地优化纳豆激酶发酵条件。

产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵条件的响应面优化

采用实验室前期构建的能够高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株,对其液体发酵条件进行优化。通过单因素实验和响应面Box-Behnken模型优化液体发酵培养参数,五因素三水平的响应面分析表明最佳发酵培养条件为:蛋白胨26.05 g/L,葡萄糖29.29 g/L,MgSO_4 1.5 g/L,CaCl_2 0.74 g/L,NaCl 10 g/L,pH 9.0,接种量3%。在最优发酵培养条件下,纳豆激酶最高酶活达到2 186.17 IU/mL,比优化前提高了269%,这表明响应面法优化枯草芽孢杆菌工程菌能够明显的提高纳豆激酶活性,为该菌株规模化生产纳豆激酶提供了基础应用参考。

枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶特性分析

分离鉴定溶栓酶高产菌株,对其所产溶栓酶的类型、相对分子质量及发酵曲线进行特性分析。从中国豆豉中分离一株纤溶酶高产菌株MX-6,经个体形态、菌落形态及16S r DNA基因同源性比对,确定该菌株为枯草芽孢杆菌。应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)克隆到1 473 bp的纤溶酶编码基因apr N,根据推测氨基酸序列与同源序列的多序列比对及系统进化树结果显示该纤溶酶为纳豆激酶。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-polyacrylamide gels electrophoresis,SDS-PAGE)确定枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的相对分子质量约28 ku,与预测的相对分子质量27 712. 72 u相吻合。枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的发酵曲线结果显示在72 h达到纳豆激酶最大合成量,在纤维蛋白平板上的溶圈直径高达21. 60 mm。为更好地实现纳豆激酶的开发及应用提供一定的理论依据和方法参考。

纳豆枯草芽孢杆菌对断奶前犊牛生长性能和免疫功能的影响

本试验旨在研究纳豆枯草芽孢杆菌对断奶前犊牛生长性能和免疫功能的影响。试验选用12头(7±1)日龄中国荷斯坦公犊牛,随机分为2个处理,每个处理6头牛。将纳豆枯草芽孢杆菌与牛奶混合饲喂给犊牛。犊牛采食量达到体重的2%时断奶,断奶时采集犊牛血液样品,测定血清中IgAI、gEI、gG、IgM及细胞因子含量。结果表明,饲喂纳豆枯草芽孢杆菌提高了犊牛日增重和饲料转化率,提前了犊牛断奶日龄,从而提高了犊牛生长性能。与对照组相比,饲喂纳豆枯草芽孢杆菌对犊牛血清中IgE、IgA和IgM水平无影响,但可显著提高IgG含量。饲喂纳豆枯草芽孢杆菌可显著提高犊牛血清中γ-干扰素浓度,对白细胞介素-4含量有提高趋势,而对白细胞介素-6和白细胞介素-10无影响。本试验表明犊牛饲喂纳豆枯草芽孢杆菌未激发犊牛体内IgE介导的过敏反应,但却提高了血清中IgG和γ-干扰素水平,说明纳豆枯草芽孢杆菌作为益生菌有益于提高犊牛免疫功能。

基于MATLAB设计纳豆枯草芽孢杆菌快速计数与筛选的方法

为实现菌落的快速计数及筛选,基于数字图片,利用MATLAB软件开发一种纳豆枯草芽孢杆菌菌落的快速计数及筛选的方法。以人工计数及筛选的结果为对照,探究不同培养时间下纳豆枯草芽孢杆菌菌种浓度对该方法准确性的影响。结果显示,本方法与人工计数及筛选结果无显著性差异,准确率达到90%以上,表明本方法可实现菌落快速、准确计数与筛选,一定程度上克服了人工计数的缺点,提高了工作效率。

枯草芽孢杆菌Natto3的筛选及其降解黄曲霉毒素B_1的初步研究

从可食用的纳豆中筛选出一株能够高效降解黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,简称AFB1)的细菌,该细菌的发酵上清液经浓缩后制成的粗酶液对AFB1降解率达到91.4%。对该菌进行了分类地位鉴定并初步研究了粗酶液的酶学性质。结果表明,该菌经生理生化和16S r DNA序列比对鉴定为枯草芽孢杆菌,并命名为Natto3。Natto3的粗酶液降解AFB1的最适培养时间为72h,最适反应温度为37℃,最适p H值是8.5,Zn2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Li+五种金属离子均会不同程度地抑制降解活性。此外,将该粗酶液添加在被黄曲霉毒素高度污染的花生样品中进行脱毒实验,可使花生中AFB1的浓度从192μg/kg降至43μg/kg。