亚砷酸钠对小鼠肝细胞AML12损伤的作用机制

目的探讨亚砷酸钠(NaAsO_(2))对小鼠肝细胞AML12损伤作用的机制。方法取对数生长期的小鼠正常肝细胞AML12,设置6个NaAsO_(2)浓度[0(对照)、10、15、20、25及30μmol/L]组,分别用相应浓度的NaAsO_(2)处理AML12细胞24 h;采用化学比色法和油红O染色法检测各组AML12细胞内丙二醛(MDA)和脂质含量水平,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot法分别检测各组小鼠AML12细胞内法尼醇X受体(FXR)、小异二聚体伴侣(SHP)mRNA和FXR、SHP、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白的表达。结果与对照组相比,10-30 μmol/L NaAsO_(2)组小鼠AML细胞内MDA含量升高、但FXR和SHP mRNA及FXR蛋白相对表达量下降(P<0.05),2-33 pmol/L NaAsO_(2)组小鼠AML细胞内脂滴含量增加(P<0.05),20-30 μmol/L NaAsO_(2)组小鼠AML细胞内SHP蛋白相对表达量降低(P<0.05),25-30 μmol/L NaAsO_(2)组小鼠AML细胞内BAX蛋白相对表达量增高(P<0.05)。结论NaAsO_(2)可致小鼠肝细胞AML12损伤,其机制可能与FXR-SHP信号通路的失调有关。

亚砷酸钠对NE-4C细胞Nrf2及Hippo信号通路的影响

目的探讨亚砷酸钠对NE-4C细胞的核因子-类胡萝卜素2相关因子(nf-e2-related factor 2,Nrf2)通路及河马(Hippo)信号通路的影响。方法以不同浓度亚砷酸钠干预细胞48h,采用CCK-8法检测细胞活力;分别采用Western blot法检测亚砷酸钠对NE-4C细胞Nrf2通路相关蛋白的影响,qRT-PCR检测亚砷酸钠对NE-4C细胞Hippo信号通路相关分子mRNA表达的影响。结果亚砷酸钠干预NE-4C细胞48h后,除0.2、0.4μmol/L组外,各干预组细胞活力随亚砷酸钠浓度的增加而降低;亚砷酸钠干预后抗氧化蛋白指标Nrf2、血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达升高,Kelch样ECH联合蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)蛋白表达降低,呈剂量依赖性,提示亚砷酸钠可诱导NE-4C细胞产生氧化应激进而激活抗氧化系统;Hippo信号通路核心分子哺乳动物STE20激酶(mammalian STE20-like protein kinase 1,MST1)、Salvador同系物1(salvador homolog 1,SAV1)、Mps结合激酶激活物1(Mps once binder kinase activator like 1,MOB1)、大肿瘤抑制基因1(large tumor suppressor homolog 1,LATS1)、Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)mRNA的表达水平随亚砷酸钠浓度的增加而升高。结论亚砷酸钠可抑制NE-4C细胞增殖,诱导细胞产生氧化应激并激活Hippo信号通路。

亚砷酸钠对小鼠肝细胞AML12氧化应激、凋亡及MST1、MST2蛋白表达的影响

目的探讨亚砷酸钠(NaAsO_(2))对小鼠肝细胞AML12氧化应激、凋亡及哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)、MST2蛋白表达的影响。方法取对数生长期的小鼠正常肝细胞AML12,分为对照组(不含NaAsO_(2))及实验组(10、15、20、25及30μmol/L NaAsO_(2)处理24 h),采用荧光探针染色法和化学比色法分别检测各组小鼠AML12细胞内活性氧(ROS)含量和超氧化物歧化(SOD)活性水平,采用Western blot检测各组小鼠AML12细胞的MST1、MST2、磷酸化MST1/2(p-MST1/2)及半胱氨酸蛋白酶3剪接体(c-caspase 3)蛋白相对表达量。结果与对照组相比,随着NaAsO_(2)浓度的增加,各实验组小鼠AML12细胞内ROS含量逐渐升高(P<0.05),SOD活性逐渐降低(P<0.05);与对照组相比,各实验组小鼠AML12细胞内p-MST1/2蛋白相对表达量升高(P<0.05),20-30μmol/L NaAsO_(2)组小鼠AML12细胞内为MST1蛋白相对表达量降低、c-caspase 3蛋白相对表达量升高(P<0.05),15-30μmol/L NaAsO_(2)组小鼠AML12细胞内MST1蛋白相对表达量升高(P<0.05)。结论NaAsO_(2)可促进小鼠肝细胞AML12发生氧化应激、凋亡及p-MST1/2、MST1、MST2蛋白表达异常。

NaAsO_(2)染毒HaCaT细胞中丝氨酸合成途径关键酶的表达及其作用

[背景]丝氨酸合成途径(SSP)关键酶在肿瘤的生长、增殖、侵袭中发挥重要作用,但其在砷致癌中的作用尚不明确。[目的]以人永生化皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)和NaAsO_(2)所致恶性转化HaCaT(T-HaCaT)细胞为研究对象,观察NaAsO_(2)染毒对SSP关键酶[如磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)、磷酸丝氨酸转氨酶1(PSAT1)和磷酸丝氨酸磷酸酶(PSPH)]表达及对细胞增殖、迁移能力的影响,探讨SSP关键酶在砷致癌中的作用。[方法](1)取课题组前期构建的T-HaCaT细胞,实验分组为传代对照(0μmol·L^(-1)NaAsO_(2))组、THaCaT(0.5μmol·L^(-1)NaAsO_(2))组、NCT503(PHGDH抑制剂,25μmol·L^(-1)组、NCT503(25μmol·L^(-1)+T-HaCaT(0.5μmol·L^(-1)NaAsO_(2))组。Western blotting法检测传代对照组和T-HaCaT组细胞的SSP关键酶蛋白表达水平,CCK8法和细胞划痕试验分别检测各组细胞的增殖率和迁移率。(2)取生长良好的对数生长期HaCaT细胞,以0、0.625、1.25和2.5μmol·L^(-1)NaAsO_(2)染毒细胞0、24、48和72 h,检测细胞增殖率和SSP关键酶的蛋白表达水平。后续实验给予HaCaT细胞25μmol·L^(-1)NCT503预处理6 h后,用2.5μmol·L^(-1)NaAsO_(2)继续染毒72 h,实验分组为对照(0μmol·L^(-1)NaAsO_(2))组、染毒(2.5μmol·L^(-1)NaAsO_(2))组、预处理组(25μmol·L^(-1)NCT503)、预处理(25μmol·L^(-1)NCT503)+染毒(2.5μmol·L^(-1)NaAsO_(2))组,检测各组细胞的增殖率。[结果] T-HaCaT组细胞中PHGDH的蛋白表达水平是传代对照组的1.60倍(P <0.05),其增殖率(177.51%±14.69%)和迁移率(53.85%±0.94%)高于传代对照组[(100.00%±0.00%)、(24.30%±2.26%)](均P <0.05)。NCT503干预后,NCT503+T-Ha CaT组细胞的增殖率(144.97%±8.08%)和迁移率(35.80%±0.99%)较T-HaCaT组细胞降低(均P <0.05)。NaAsO_(2)染毒72 h后HaCaT细胞的增殖率随染毒浓度的增加而增加(r=0.862,P <0.05),与此一致,各染毒组HaCaT细胞中SSP关键酶的蛋白水平均较对照组表达增加(均P <0.05)。2.5μmol·L^(-1)NaAsO_(2)染毒后的HaCaT细胞增殖率随染毒时间的延长而增加(r=0.775,P <0.05),与细胞中PHGDH蛋白表达水平的变化一致。NCT503干预后,预处理+染毒组细胞增殖率低于染毒组细胞(P <0.05)。[结论] SSP关键酶可能在NaAsO_(2)所致的T-HaCaT细胞增殖中扮演重要的角色。

亚砷酸钠对神经干细胞活力及YAP蛋白表达的影响

目的探讨亚砷酸钠对神经干细胞活力及转录共激活因子Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)表达的影响。方法以不同浓度(0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L)亚砷酸钠干预NE-4C细胞48 h,倒置显微镜观察细胞形态变化,CCK-8法检测细胞活力,Western Blot检测亚砷酸钠对细胞YAP、P-YAP蛋白的影响,qRT-PCR检测亚砷酸钠对YAP下游靶基因Gli2、Tead1、Tead2 mRNA表达的影响。结果亚砷酸钠引起细胞缩小,胞体萎缩,上清液中漂浮细胞及细胞碎片增加,贴壁能力显著下降,出现大面积死亡,各干预组细胞活力随亚砷酸钠浓度的增加而降低;亚砷酸钠干预后YAP蛋白表达升高,P-YAP蛋白表达降低,P-YAP/YAP相对表达水平呈下降趋势,提示亚砷酸钠可激活YAP,使其入核水平增加;YAP下游靶基因Gli2、Tead1、Tead2 mRNA的表达水平随亚砷酸钠浓度的增加而升高。结论亚砷酸钠可抑制NE-4C细胞活力、诱导细胞损伤,其可能机制与YAP蛋白的应激性清除受损细胞有关。

白藜芦醇对妊娠期至性成熟期亚砷酸钠暴露子代小鼠学习记忆和脑氧化应激损伤的保护作用

目的 研究白藜芦醇(RES)对妊娠期至性成熟期亚砷酸钠(NaAsO_(2))暴露子代小鼠发育早期学习记忆和脑氧化应激的影响,探讨砷暴露所致学习记忆受损的可能机制及防治措施。方法 将36只妊娠小鼠分为对照组(12只)及染砷组(24只,饮用含60 mg/L NaAsO_(2)水),其子代小鼠在断乳后至实验结束以饮水方式染砷。仔鼠出生后28 d饮水染砷同时给予RES灌胃干预:来自对照组窝别的仔鼠随机分为对照组和50 mg/kg RES组,来自染砷组的仔鼠随机分为NaAsO_(2)组、NaAsO_(2)+(25、50、100 mg/kg)RES组,每组6只。RES灌胃干预4周,进行水迷宫实验,取各组仔鼠血清和脑组织测定还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平。结果 从训练第4天起,NaAsO_(2)组仔鼠寻找平台潜伏期显著长于对照组,NaAsO_(2)+RES组仔鼠寻找平台潜伏期显著短于NaAsO_(2)组(P<0.05);空间探索时NaAsO_(2)组仔鼠在目标象限停留时间显著短于对照组,NaAsO_(2)+(25、50 mg/kg)RES组仔鼠在目标象限停留时间显著长于NaAsO_(2)组(P<0.05)。与对照组相比,NaAsO_(2)组仔鼠血清和脑组织中SOD和GSH活性显著下降,LDH和MDA水平明显升高;与NaAsO_(2)组相比,NaAsO_(2)+RES组血清及脑组织中SOD和GSH活性显著升高,LDH和MDA水平显著下降;差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 RES可改善砷暴露子代小鼠的氧化应激损伤,从而可能改善砷所致学习记忆能力损伤。

NLRP3炎症小体介导的炎症反应参与亚砷酸钠所致胰岛β细胞毒性损伤

目的探讨NLRP3炎症小体介导的炎症反应在亚砷酸钠(NaAsO2)诱发小鼠胰岛β细胞MIN6毒性损伤中的作用。方法筛选NLRP3炎症小体抑制剂MCC950的最适处理浓度,并将MIN6细胞分为正常对照组、MCC950对照组、亚砷酸钠组、MCC950+亚砷酸钠组。应用倒置显微镜观察细胞生长状态;MTS法检测细胞存活率;TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡;Real-time RT-PCR和Western blot检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA和蛋白表达。结果与亚砷酸钠组相比,MCC950+亚砷酸钠组细胞生长状态和存活率显著提升,细胞凋亡数量明显下降。亚砷酸钠组NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA和蛋白表达水平均高于正常对照组;MCC950干预明显降低亚砷酸钠染毒所致的NLRP3炎症小体活化,显著减少IL-1β、IL-18的蛋白表达水平。结论NLRP3炎症小体介导的炎症反应参与亚砷酸钠所致小鼠胰岛β细胞MIN6毒性损伤。

亚砷酸钠及其代谢产物对A549细胞中环状基因表达的影响

分别用浓度为20、40、60μmol/L的亚砷酸钠(NaAsO_(2))溶液和无机砷的代谢产物一甲基胂酸(MMA)、二甲基胂酸(DMA)对处于对数生长期的人肺腺癌A549细胞处理48 h,提取RNA并逆转录为cDNA,用聚合酶实时荧光定量反应(qRT-PCR)检测hsa_circ_0004448、hsa_circ_0027493、hsa_circ_0000416、circRELB、circFOXN2、circATXN2 6个环状基因(circRNAs)的相对表达量。结果表明,与对照组比较,不同浓度的NaAsO_(2)溶液均可引起A549细胞中上述circRNAs表达量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,DMA仅使hsa_circ_0004448和circATXN2表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。经MMA染毒后,上述6个circ-RNAs的相对表达量均无变化,差异无统计学意义(P>0.05)。与NaAsO_(2)组比较,MMA组和DMA组中6个circRNAs表达量均降低,差异有统计学意义(P<0.01)。