湖南省猬迭宫绦虫的线粒体cox1和nad1基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明猬迭宫绦虫湖南分离株线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位l基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列重构猬迭宫绦虫与其它绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增猬迭宫绦虫的pcox1和pnad1,应用ClustalX1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAStar5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示所获得各样品株的pcox1和pnad1序列长度一致,分别为396和566bp,湖南分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分枝。由于猬迭宫绦虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为猬迭宫绦虫的种群体遗传学研究和其相关疾病的诊断奠定基础。

湖南省鸡蛔虫线粒体cox1和nad1基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明湖南省鸡蛔虫分离株线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位l基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列构建鸡蛔虫与其它科蛔虫的种群遗传关系。作者应用聚合酶链反应(PCR)扩增鸡蛔虫虫株的pcox1和pnad1,应用ClustalX1.81程序对序列进行比对,然后用Phylip3.67程序MP法和Mega4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树。所获得的pcox1和pnad1序列长度均为394和408bp,种系发育树表明,20个分离株鸡蛔虫位于同一分枝。由于鸡蛔虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记。本研究系首次报道鸡蛔虫的pcox1和pnad1序列,从而为鸡蛔虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础。

湖南省山羊脑多头蚴的线粒体nad1和nad4基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明脑多头蚴湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位4基因(nad4)部分序列(pnad4)的遗传变异情况,并用pnad1和pnad4序列重构脑多头蚴与其它带科绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增脑多头蚴的pnad1和pnad4,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAstar5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示所获得的pnad1和pnad4序列长度分别均为666和887bp,湖南分离株与已知多头带绦虫位于同一分枝。由于脑多头蚴pnad1和pnad4序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为脑多头蚴的分子流行病学和其相关疾病的诊断奠定基础。

犬泡状带绦虫线粒体cox1和nad1基因的扩增与种系发育分析

以采自广州和佛山的犬泡状带绦虫为研究对象,利用PCR技术扩增其线粒体基因组的细胞色素c氧化酶第亚基（cox1）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原酶第一亚基（nad1）序列,扩增产物经纯化、克隆和测序。结果扩增出泡状带绦虫线粒体cox1基因序列长度为444 bp,nad1基因序列长度为530 bp。将实验获得序列与GenBank收录的相关序列进行比对分析,发现采自不同国家和地区的泡状带绦虫cox1基因差异度较小（02.3%）,而nad1基因的差异度较大（0.214.2%）,对进一步研究泡状带绦虫的群体遗传结构奠定了基础。

西施舌3个群体H2A基因和nad6-nad1片段序列比较研究

西施舌（Coelomactra antiquata）浮游幼虫EST序列拼接获得组蛋白H2A ORF及其两翼的非编码区,在ORF两翼设计引物Can-H2AF和Can-H2AR,扩增H2A基因片段;从nad6 3′端和nad1 5′端设计引物,扩增两基因区域DNA序列,测序并进行核苷酸序列差异分析,研究漳州西施舌分化水平。结果：共获得西施舌3个群体H2A基因606bp或616bp基因区DNA片段23条,检测到9种基因型（Gen）。西施舌漳州群体H2A基因AT含量（51.51%）高于日照、北海群体AT含量（50.58%）;序列比对分析显示,简约信息位点占4.05%。基于H2A基因的漳州群体与日照/北海混合群体间遗传距离平均为0.044,漳州群体,混合群体内遗传距离分别为0.003和0.004,群体间与群体内遗传距离之比为11-14.7;AMOVA分析结果显示,漳州群体和混合群体间发生了极显著遗传分化（FST=0.937,P〈0.01）。从nad6-nad1片段中共检出7种单倍型（Hap）,漳州群体与日照群体无共享单倍型,基于nad6-nad1的漳州群体与日照群体间遗传距离为0.199-0.202,群体间与群体内遗传距离之比50-66,两个群体间nad1多肽链一级结构存在极大差异,有9个位点的氨基酸不同,日照西施舌缺失6个氨基酸。线粒体DNA显示西施舌漳州与日照群体发生了明显的遗传分化。

猬迭宫绦虫裂头蚴线粒体nad1基因部分序列的多态性研究

从湖南省4个不同地区的黑斑蛙大腿肌肉中采集猬迭宫绦虫裂头蚴作为研究对象,用引物Nad1u及Nad1d扩增猬迭宫绦虫裂头蚴的nad1基因片段,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,同时利用DNAStar 5.0中的MeGalign程序进行同源性分析。结果显示猬迭宫绦虫裂头蚴nad1序列均为570 bp。研究结果为猬迭宫绦虫裂头蚴进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。

湖南省鸡蛔虫线粒体nad1基因部分序列的测定及分析

本研究旨在阐明鸡蛔虫湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1(nad1)基因部分序列(pnad1)遗传变异情况。利用聚合酶链式反应(PCR)扩增鸡蛔虫的pnad1,应用Clustal X 1.81程序对序列进行比对。结果显示,所获得的pnad1序列长度一致,为408 bp。由于鸡蛔虫pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记,从而为鸡蛔虫的分类鉴定及进一步的分子流行病学调查奠定了基础。

新疆北疆部分地区牛羊包虫病流行病学调查与cox1和nad1基因分析

为掌握北疆部分地区牛羊包虫病流行情况及虫种(基因型)分布特点,2019年4月至2019年9月在北疆阿勒泰、昌吉和伊犁部分屠宰场对牛(n=210头)和绵羊(n=2294头)进行调查。确诊宿主共有40例,平均感染率为1.60%,其中昌吉的感染率(3.85%)最高。将5头牛和51只绵羊肝肺上采集的78个疑似包囊样本进行PCR扩增,结果显示,源自37个宿主共57个疑似包囊样本检测cox1基因呈阳性;源自39个宿主共59个疑似包囊样本检测nad1基因呈阳性。PCR产物测序和单倍型分析结果表明,所有分离株均为细粒棘球蚴G1基因型,包括25个单倍型(cox1)和8个单倍型(nad1)。本研究揭示单个宿主可以感染多个单倍型,表明一个宿主可能感染不同的虫株。该试验结果为北疆包虫病分子流行病学研究提供参考数据。

花烟草NaD1基因的表达及其启动子序列分析

花烟草(Nicotiala alata)的花中存在的植物防御素Nicotiala alata defensin 1(NaD1),对多种致病性真菌具有防御活性,在天然防御免疫系统中发挥着重要作用。本研究分别对花烟草根、茎、叶、花组织部分以及伸根期、旺长期、成熟期发育阶段叶片中NaD1基因的表达量进行qRT-PCR定量检测,结果显示,NaD1基因在花中表达量显著高于其他组织,在叶片中的表达量随着植物的生长发育先增加后降低。此外,通过热不对称交错PCR克隆得到NaD1基因5′端上游644 bp的片段,利用BDGP和Plant CARE在线软件分析启动子的转录起始位点及motif元件,发现其含有基本启动子元件和其他顺式作用元件,如光反应元件BOX-Ⅰ、乙烯反应元件ERE以及真菌诱导响应元件TGACG-motif等。通过对花烟草进行光胁迫处理,发现NaD1基因在花中的表达量随着暗处理时间的增长而显著增加,随着光处理时间的增长而显著降低,这与其启动子中存在的光反应元件BOX-Ⅰ相对应。通过启动子5′端缺失分析,构建了pCAMBIA1391z-pNaD1-644∶∶GUS与pCAMBIA1391z-pNaD1-310∶∶GUS两个植物表达载体,利用遗传转化获得包含-644~-1 bp和-310~-1 bp启动子片段的转基因烟草,GUS染色结果表明,NaD1基因启动子的核心区域在-310~-1 bp中,为进一步研究NaD1基因的功能和转录调控机制奠定了基础。

山羊脑多头蚴线粒体nad1基因的克隆及序列分析

本研究旨在阐明脑多头蚴湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pnad1序列重构脑多头蚴与其他带科绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增脑多头蚴的pnad1,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAStar 5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示,所获得的pnad1序列长度分别均为430bp,湖南分离株与已知多头带绦虫位于同一分枝。由于脑多头蚴pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为脑多头蚴的分子流行病学和其相关疾病的诊断奠定基础。

不同地区褐黄血蜱的基因变异及遗传进化分析

为探究不同区域褐黄血蜱的基因变异情况及其遗传进化关系,试验以采集自湖南、河南省的20只褐黄血蜱为研究对象,通过PCR扩增其内转录间隔区Ⅱ(ITS-2)和烟酰胺脱氢酶亚基Ⅰ(nad1)基因序列,并对所获序列进行基因变异分析;在所获ITS-2和nad1基因序列的基础上,对不同地区褐黄血蜱的遗传进化关系进行分析,并利用ITS-2和nad1基因序列分别构建褐黄血蜱的系统进化树。结果显示,褐黄血蜱ITS-2基因序列长度均为1160 bp,nad1基因序列长度均为285 bp;两省褐黄血蜱ITS-2及nad1基因的种内差异分别为0~1.9%和0~0.4%;湖南省褐黄血蜱的种内差异分别为0~1.4%和0~0.4%,而河南省的种内差异分别为0~1.2%和0~0.4%;两省褐黄血蜱ITS-2及nad1基因的种间差异分别为37.0%~52.0%和13.6%~24.8%。系统进化树结果显示,所有来自于两省的褐黄血蜱共处于同一分支上。结果表明,来自于两省的褐黄血蜱之间均存在基因变异的现象,但湖南省褐黄血蜱的基因变异程度和遗传多样性均高于河南省;两省褐黄血蜱之间的亲缘关系较近,暗示两省褐黄血蜱之间有基因交流,未出现遗传分化。

河南济源地区奶牛肝片吸虫感染情况调查

为了解河南济源地区奶牛肝片吸虫感染情况,以期为该病的防制和进一步研究奠定基础,本研究采用尼龙袋集卵法对奶牛粪便中虫卵进行收集、镜检,摸清奶牛肝片吸虫病在济源市流行情况,利用PCR技术对肝片吸虫分离株线粒体nad1基因序列进行扩增与分析。结果显示,13份样品检测为阳性,阳性率为5.41%,13个分离株nad1序列长度基本一致,为488～494bp,各分离株间同源性为99.3%～100.0%;种系发育分析结果显示,所有的济源市分离株与Genbank收录的肝片吸虫分离株位于同一大分支,与大片吸虫所属分支较远。

基于线粒体nad1基因的大理州亚洲带绦虫遗传多样性分析

目的了解云南省大理州亚洲带绦虫的遗传多样性。方法2019年5月-2021年8月从大理市(DL)、巍山县(WS)、弥渡县(MD)、漾濞县(YB)和洱源县(EY)5个地区采集到131份亚洲带绦虫样本,利用PCR技术扩增其线粒体nad1基因序列,运用MEGA7.0和DNASP5.10.01软件对所得序列进行分析,计算其碱基含量、遗传多样性参数、遗传分化系数和基因流以及遗传距离等数据。结果5个亚洲带绦虫群体的nad1基因片段大小均为1058 bp,A、T、G、C的碱基平均含量分别为22.0%、48.2%、23.0%和6.8%;比对发现131条亚洲带绦虫共形成53个单倍型,其中单倍型多样性为0.9485,核酸多样性为0.0101;遗传分化指数和基因流范围分别为-0.0012~0.1072和2.0825~283.8409;遗传距离为0.0052~0.0189,MD与YB之间的遗传距离最大,DL与EY之间的遗传距离最小。中性检验结果显示,大理州5个群体的Tajima’s D和Fu’s Fs值均为负值,分别为-2.2477~-0.5001和-4.1664~-0.4196,DL和YB两个群体为显著负值,差异有统计学意义(P<0.05),推测这2个群体可能发生过群体扩张。结论大理州亚洲带绦虫群体遗传多样性水平较高,种群间基因交流频繁,遗传分化较弱,DL与MD群体间存在中等程度的遗传分化。

线粒体nad1/b-c及nad5/d-e在秦艽组植物中物种鉴定意义的评价

龙胆科龙胆属Gentiana秦艽组Sect.Cruciata多种植物作为中药秦艽及藏药解吉(■)的基原,具有重要的药用价值。在课题组前期品种整理及遗传背景分析基础上,本文分别测定秦艽组10种23个居群69份样品以及外类群椭圆叶花锚Halenia elliptica 3份样品的线粒体nad1基因第2内含子区(nad 1/b-c)以及nad5基因第4内含子区(nad5/d-e)部分序列,对其在秦艽组植物的分子系统发育分析及物种鉴定中的意义进行评价。结果显示:nad1/b-c具一粗壮秦艽G.robusta King ex Hook.f.稳定变异位点;同时,对粗茎秦艽G.crassicaulis Duthie ex Burk.及西藏秦艽G.tibetica King ex Hook.f.有一定物种分辨率;nad5/d-e序列相似度高,仅大叶秦艽G.macrophylla Pall.、黄管秦艽G.officinalis H.Smith及管花秦艽G.siphonantha Maxim.ex Kusnez.存在种内不同基因型。进而基于粗壮秦艽G.robusta King ex Hook.f.nad 1/b-c物种分子标记,设计一特异鉴定引物,建立粗壮秦艽特异性引物-PCR鉴定方法。本工作可为协同进化不完全、遗传背景复杂多样的中藏药高山基原植物DNA条形码的构建提供新思路。

西昌市鸡蛔虫线粒体cyt b和nad1基因的遗传变异分析

为研究西昌市鸡蛔虫的种内遗传变异和系统发生关系,用线粒体细胞色素b(cyt b)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位Ⅰ(nad1)基因全序列分析了17个鸡蛔虫西昌分离株的遗传变异,并用cyt b和nad1序列构建鸡蛔虫与其他蛔虫的种系发育关系。测序结果显示:17株鸡蛔虫cyt b和nad1全序列长度分别为1 104 bp和876 bp,碱基变异率分别为02.4%和02.3%;分别检测到10个和7个单倍型,总的单倍型多样性分别为0.897±0.056和0.824±0.064,核苷酸多样性分别为0.004 70±0.001 61和0.004 21±0.001 65,平均遗传距离分别为0.005和0.004。构建的种系发育树均显示17个鸡蛔虫西昌分离株与其他国家/地区的鸡蛔虫分离株聚类形成一个分支,与鸽蛔虫的亲缘关系最近,与其他蛔虫所属的分支相隔较远。研究结果表明鸡蛔虫西昌分离株的遗传变异程度低,且cyt b基因比nad1基因更适合作为研究鸡蛔虫种内遗传变异的分子标记。

青海省细粒棘球蚴线粒体cox1基因和nad1基因多态性的研究

分析了采自青海省7个县共19个细粒棘球蚴分离株样品的nad1基因和cox1基因核苷酸序列的多态性和单倍型。结果显示,18个细粒棘球蚴分离株属于G1型,1个分离株属于G3型。G1型分离株可根据nad1基因和cox1基因的核苷酸序列变异分为不同的单倍型,其中nad1基因的单倍型共有5种,变异位点只有5个,单倍型序列之间碱基差异1~4个,变异率达0.45%;而cox1基因的单倍型共有9种,涉及变异位点共27个,单倍型序列之间碱基差异1~11个,变异率达0.68%。突变碱基多位于密码子第3位碱基上,属于同义突变。cox1基因的多态性比nad1基因的多态性丰富。用于细粒棘球蚴G1型内分离株之间核苷酸多态性的分析则分辨率相对较高。上述研究结果为进一步开展棘球蚴病分子流行病学调查积累了数据。

西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株nad1基因多态性分析

目的了解西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株的优势基因型及遗传变异情况,为细粒棘球绦虫的溯源及阿里地区棘球蚴病预防控制策略的制定提供支持。方法收集阿里地区某医院2017年棘球蚴病患者病灶切除样品,提取DNA,PCR扩增线粒体NADH脱氢酶1(nad1)基因,扩增产物测序后用BLAST、ClustalX 1.83和MEGA 7.0软件进行同源性和系统进化分析。下载全国细粒棘球蚴人体分离株的nad1基因,利用DnaSP6分析单倍型;利用NetWork软件制作中国细粒棘球绦虫nad1基因的单倍型网络图。结果共收集80例细粒棘球蚴病患者病灶切除样品,其中38份样品PCR扩增出约550 bp的特异性条带。测序分析结果显示,4份样品为细粒棘球绦虫G6基因型,与蒙古人来源的序列(MH300971.1)一致性为99.8%;其余34份样品均为细粒棘球绦虫G1基因型,与标准序列(AF297617.1)相比,其535位的C碱基突变为G碱基,与阿尔及利亚人来源序列(MG672293.1)的一致性为100%。MEGA 7.0软件分析38份样品的序列,结果显示,T、C、A和G碱基占比依次为44.3%~46.5%、7.7%~9.1%、19.8%~21.5%和25.7%~26.0%。我国已报道的细粒棘球绦虫nad1基因共有9个单倍型,单倍型多样性为0.47,核酸多样性为0.19。单倍型网络图显示,H4为我国细粒棘球绦虫nad1基因主要的单倍型。结论细粒棘球绦虫G1、G6基因型是西藏阿里地区的主要基因型,资料分析表明H4为我国流行的细粒棘球绦虫nad1基因的主要单倍型。

3种常见人体寄生虫NAD1基因的电子克隆及对比分析

目的利用电子克隆法对人体寄生虫NAD1基因进行电子克隆和生物信息学分析,为NAD1基因的进一步深入研究奠定基础。方法分别选取华支睾吸虫、蛔虫和日本血吸虫的一个表达序列标签(EST)片段作为种子序列,以NCBI中的EST数据库作为目标参考序列,用电子克隆的方法分别克隆3种寄生虫的NAD1基因,并对其编码蛋白的理化性质、氨基酸组成、亚细胞定位、二级和三级结构进行对比分析。结果 3种人体寄生虫NAD1蛋白理化性质、亚细胞定位、相对分子量、等电点差异较小,蛔虫和日本血吸虫的NAD1蛋白在三级结构上高度相似。进化分析显示,3种人体寄生虫的NAD1蛋白分属不同分支,存在一定的遗传距离。结论通过电子克隆得到的3个NAD1基因是属于不同种属的同一基因,可广泛应用于研究寄生虫的种间和种内遗传变异。

青海省多房棘球绦虫分子种系发生研究

目的对青海省多房棘球绦虫分离株Cox1、Nad1基因进行扩增和测序,并构建系统进化树及分子钟,为推测其进化关系及起源提供参考依据。方法收集2017年青海省人民医院收治的22份肝多房棘球蚴病患者术后标本,对多房棘球蚴线粒体DNA Cox1、Nad1基因进行PCR扩增和测序,并与Gen Bank数据库中的棘球属绦虫Cox1基因和Nad1基因序列进行比对,观察种内变异情况并构建进化树和分子钟。结果所有多房棘球绦虫标本与Gen Bank数据库中检索的多房棘球绦虫亚洲株Cox1、Nad1基因序列同源性均达99%以上,共获得6种不同基因型,其中有2个分离株在Gen Bank数据库中未找到同源性100%的基因序列。系统进化树显示,收集的多房棘球绦虫标本与多房棘球绦虫亚洲株聚类效果明显;分子钟推测青海地区多房棘球绦虫起源于9.4万年前。结论本研究发现青海省多房棘球绦虫存在6种不同基因型,其中首次发现2种基因型。青海地区多房棘球绦虫优势株为亚洲株,起源时间约在9.4万年前。

青海人源两型棘球绦虫(棘球蚴)遗传多样性及分化时间研究

目的 分析青海人源细粒棘球绦虫(细粒棘球蚴)和多房棘球绦虫(多房棘球蚴)遗传多样性、群体间遗传差异及分化时间,为青海省棘球绦虫溯源及防控提供科学依据。方法收集2016—2021年青海大学附属医院住院棘球蚴病患者肝病灶样品50份,提取基因组DNA, PCR扩增线粒体脱氢酶1 (nad1)基因,采用Clustal X v2.0软件对序列进行多重比对,应用ArcGIS软件进行患者居住地的地理信息学构图,应用DnaSP v6软件对序列单倍型进行分析,应用Modeltest 3.7软件及PAUP*4.0B10软件运行计算最小最适核酸进化模型,用Mr Bayes-3.2.7软件构建贝叶斯系统进化树,通过BEAST v2.6.3软件用贝叶斯方法估算系统进化树各节点的分化时间。结果成功鉴定出48份棘球蚴病灶样品,获得长度为894 bp的nad1完整基因序列。其中13份样品被鉴定为细粒棘球绦虫G1基因型,35份样品被鉴定为多房棘球绦虫。所有序列均与GenBank中的序列具有大于99%的相似度。两种棘球绦虫分别鉴定出4个单倍型H1~H4:细粒棘球绦虫以H3为主导单倍型(占10/13),分布在西宁、果洛、玉树、海东、海北和黄南等地;多房棘球绦虫以H2为优势单倍型(占51.4%, 18/35),分布在西宁、果洛、玉树、海东等地。系统发育进化树显示,细粒棘球绦虫与G1基因型聚为一支,多房棘球绦虫与亚洲株聚为一支。分化时间分析结果显示,棘球属中细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、福氏棘球绦虫、少节棘球绦虫最近共同祖先存在大约5.5百万年前(millions of years ago, Mya)(95%置信区间4.5~6.5 Mya),细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫分化的时间大约为2.5 Mya (95%置信区间2.3~4.1 Mya)。结论 青海省人源细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫均表现出较高的遗传多样性,细粒棘球绦虫为G1基因型,以H3为主导单倍型,多房棘球绦虫以H2为优势单倍型,二者均广泛分布于青海各地。棘球属中细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫的亲缘关系较近且分化时间也较近。