褪黑素对荷胃癌小鼠胸腺及脾CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的影响

目的：研究褪黑素在抑制肿瘤过程中对荷胃癌小鼠胸腺及脾CD4＋CD25＋调节性T（Treg）细胞表达变化的影响.方法：培养小鼠前胃癌细胞株（MFC）,采用小鼠荷胃癌模型.用褪黑素干预1周后,测量小鼠胸腺、脾质量;并用流式细胞仪检测胸腺、脾Treg细胞;用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测胸腺、脾叉头型转录因子3 （Foxp3）的表达.结果：与正常对照组相比,小鼠胸腺、脾质量各组之间差异无统计学意义.在褪黑素抗肿瘤过程中,与正常对照组相比,荷瘤空白对照组小鼠胸腺与脾的Treg细胞均上升,褪黑素干预后降至正常水平;褪黑素还能使小鼠胸腺Foxp3 mRNA表达下降,脾Foxp3 mRNA反而上调;而小鼠胸腺、脾scurfin蛋白均明显下降.结论：褪黑素能下调荷胃癌小鼠胸腺、脾的CD4＋CD25＋Treg细胞及特异性转录蛋白scurfin及胸腺Foxp3 mRNA,使脾Foxp3 mRNA反而上调.褪黑素抗胃癌作用与免疫器官中CD4＋CD25＋Treg细胞免疫调节有关.

实验性自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠脾和中枢神经系统中CD4^+T细胞的动态变化

利用MOG35-55多肽的抗原乳剂和百日咳毒素诱导C57BL/6小鼠EAE模型,分别于发病初期S1(Day 17)、发病高峰期S2(Day 25)、平台初期S3(Day 40)、平台后期S4(Day 52)取材。采用流式细胞仪检测4个时间点EAE小鼠脾单个核细胞中CD4^+T细胞的比例,采用免疫组化法观察4个时间点中枢神经系统各部位CD4^+T细胞的浸润情况。结果显示,在EAE小鼠的发病过程中,脾中的CD4^+T细胞在S1、S2期的比例持续升高,在S2期达到最高值,但到S3期比例开始降低。免疫组化结果显示,随着疾病的发展,EAE小鼠中枢神经系统不同部位的CD4^+T细胞浸润均呈现先增加后降低的特点,而且在各个时期,脊髓中的CD4^+T细胞浸润最明显,其次是大脑,再次为脑干。CD4^+T细胞动态变化结果说明,外周和中枢的CD4^+T细胞均主要在EAE的发病初期和发病高峰期发挥致病效应。

小鼠脾脏间充质干细胞调节T淋巴细胞的增殖与活化

目的研究小鼠脾脏间充质干细胞(Sp-MSCs)对T淋巴细胞增殖与活化的调节作用。方法采用组织块法从小鼠脾脏中分离培养出Sp-MSCs,并做多向诱导分化实验。分离小鼠T淋巴细胞,开展淋巴细胞转化试验和混合淋巴细胞反应,分别检测Sp-MSCs对于非特异抗原和同种异体抗原活化的T淋巴细胞的影响。以CFSE流式法检测Sp-MSCs对活化的T淋巴细胞增殖的影响。采用定量PCR分析Sp-MSCs对T淋巴细胞表达的炎性细胞因子的影响。结果流式检测结果显示Sp-MSs C可以抑制非特异抗原和同种异体抗原引起的T淋巴细胞增殖。Sp-MSCs能够有效抑制淋巴细胞转化试验和混合淋巴细胞反应引起的细胞活化。进一步分析发现,Sp-MSCs抑制T淋巴细胞表达干扰素γ,肿瘤坏死因子α和白细胞介素17A。结论 Sp-MSCs能够抑制T淋巴细胞增殖与活化,抑制T淋巴细胞表达多种炎性细胞因子。

金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎小鼠脾脏Th细胞变化研究

目的:在小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎过程中,探讨脾脏内多种Th细胞亚群数量和相关细胞因子、转录因子的动态变化及其意义。方法:本研究首先建立S.aureus感染小鼠的乳腺炎模型,再利用流式细胞术和荧光定量PCR技术,分别检测脾脏中多种Th细胞亚群数量及相关因子mRNA水平。结果:在S.aureus感染小鼠乳房后的不同时间,脾脏内Th2细胞和Th17细胞占CD4^+淋巴细胞的比例分别显著增加(P<0.05),而Treg细胞比例则明显降低(P<0.05)。并且,与Th细胞分化、活化和效应相关的多种细胞因子及转录因子,均在转录水平有明显升高(P<0.05)。结论:乳腺炎不只是发生于乳腺局部的一种炎症反应,机体还能够调动脾脏的多种Th淋巴细胞亚群,以分泌细胞因子的方式,组织有效的乳腺抗S.aureus感染免疫应答。

血蓝蛋白不同免疫途径对小鼠T细胞依赖性抗体反应的影响

目的探讨以血蓝蛋白(KLH)为特异性T细胞依赖性抗原,不同免疫途径下对小鼠T细胞依赖性抗体反应(TDAR)的影响。方法选用SPF级KM小鼠,分为静脉注射组、皮下注射组、腹腔注射组及空白对照组。通过上述三种途径免疫小鼠,免疫剂量为每只200μg,第10天等剂量加强免疫一次,空白对照组不给予任何药物。于末次免疫后第7天,采血检测血清KLH抗体Ig G含量,计算脾脏器系数,HE染色观察脾组织学变化。结果 KLH三种不同免疫途径均可引起脾出现不同程度次级淋巴滤泡及生发中心的形成,B淋巴细胞凋亡,边缘区细胞增多等病理改变,以腹腔和静脉免疫途径脾形态变化更为明显;三种不同免疫途径均可引起机体产生抗体,与正常对照组相比差异具有显著性(P<0.05),其中静脉途径引起抗体产生浓度最高,明显高于其他两种免疫途径(P<0.05);各组脾脏器系数存在部分差异,其中静脉注射组和腹腔注射组脾脏器系数显著高于空白对照组(P<0.05),静脉注射组脾脏器系数显著高于皮下注射组和腹腔注射组(P<0.05)。结论 KLH三种不同免疫途径引起机体产生抗体浓度、脾脏器系数及形态改变是不完全相同的,可通过这些差异多方面分析TDAR实验结果。

千金苇茎汤含药血清对香烟烟雾暴露小鼠脾Naive T细胞Th17/Treg分化及Notch通路表达的影响

目的旨在实验观察千金苇茎汤(Phragmitis Decoction,PD)大鼠含药血清对香烟烟雾水溶液处理的小鼠脾Naive T细胞分化Th17/Treg平衡及Notch信号通路表达的影响。方法将雄性健康SD大鼠30只随机分为A和B组(生理盐水5 ml/kg·bw)、C组(100 mg/kg·bw乙酰半胱氨酸)、D组(10 g/kg·bw PD血清)、E组(5 g/kg·bw PD血清)、F组(2.5 g/kg·bw PD血清),每日灌胃2次,连续3 d。末次给药1 h后,股动脉取血制备含药血清,高效液相色谱法(HPLC)含药血清浓度。用免疫磁珠分选C57BL/6雌性健康小鼠脾Naive T细胞,通过细胞培养后将其分为6组,分别标记为空白组(接受体积无药血清DMEM培养)、模型组(接受5.0%香烟烟雾水溶液的DMEM培养)、西药血清干预组(接受含乙酰半胱氨酸血清培养)、PD高剂量血清干预组(接受含高剂量PD血清培养)、千金苇茎汤中剂量血清干预组(接受含中剂量PD血清培养)、PD低剂量血清干预组(接受含低剂量PD血清培养)。流式细胞技术检测各组Naive T细胞Th17/Treg数量及比率变化。Western blot检测Naive T细胞Notch、Jagged-1、Jagged-2、Delta-like-1、Delta-like-3和Delta-like-4等蛋白表达。采用ELISA法检测各组中Naive T细胞培养液IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β的含量。结果PD高剂量血清干预组及西药血清干预组Th17细胞相对数量明显低于模型组(P<0.05),PD高剂量血清干预组Th17细胞相对数量明显低于西药组(P<0.05)。PD高和中剂量血清干预组及血清西药干预组Treg细胞相对数量明显高于模型组(P<0.05)。PD高剂量血清干预组Delta-like-1、Delta-like-3和Delta-like-4表达明显低于模型组(P<0.05),PD高剂量血清干预组Jagged-1和Jagged-2的表达水平明显高于模型组(P<0.05),也明显高于西药血清干预组(P<0.05)。PD高和中剂量血清干预组及西药血清干预组的IL-17表达明显低于模型组(P<0.05);PD高和中剂量血清干预组IL-17表达明显低于西药血清干预组(P<0.05)。PD高剂量血清干预组IL-6表达明显低于模型组(P<0.05);PD高和中剂量血清干预组TGF-β表达低于模型组(P<0.05)差异均有统计学意义,各组IL-10表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论PD具有防治香烟烟雾暴露引起的免疫损伤作用,发现其治疗机制可能是抑制Notch信号通路的激活,具体表现为通过下调该通路中相关受体、配体等蛋白的表达来调节小鼠NaiveT细胞向Th17/Treg的分化平衡,并能抑制IL-17、IL-6和TGF-β等炎性因子表达。

淋巴细胞内三磷酸肌醇的分离与测定

本文采用细胞膜放射标记及细胞内提取物分步层析的方法测定了小鼠脾细胞及人外周血T淋巴细胞在Con A刺激条件下磷酸肌醇(IPs)的变化。结果显示:细胞内提取物洗脱液呈现五个清晰的放射活性峰,Con A(10μg/ml)处理后可使两种细胞内IPs明显增高,但小剂量的IL-2(20 U/ml)不改变人外周血T淋巴细胞内的IPs。这种细胞膜放射标记及细胞内提取物分步层析的方法可用于免疫细胞内第二信使——三磷酸肌醇(IP_3)的研究。

脂肪来源间充质干细胞移植干预系统性红斑狼疮模型小鼠的免疫功能

背景:虽然间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮已取得临床疗效,但其免疫调节的内源性功能及作用机制有待深入研究。目的:探讨来源的脂肪间充质干细胞对系统性红斑狼疮小鼠(MRL/lpr小鼠)免疫功能的影响及其可能机制。方法:将36只MRL/lpr小鼠随机分为3组:模型对照组不进行干预、磷酸盐缓冲液对照组尾静脉注射磷酸盐缓冲液、干细胞移植组尾静脉注射脂肪间充质干细胞;另取12只C57BL/6小鼠作为正常对照组。结果与结论:①分离MRL/lpr小鼠脂肪组织获得的细胞具有脂肪间充质干细胞特性;②模型对照组、磷酸盐缓冲液对照组和干细胞移植组的血清尿素氮、肌酐和抗双链DNA抗体水平均高于正常对照组(P <0.01);干细胞移植组的血清尿素氮、肌酐和抗双链DNA抗体水平低于模型对照组和磷酸盐缓冲液对照组(P <0.05);③模型对照组和磷酸盐缓冲液对照组的外周血调节性T细胞阳性率低于正常对照组和干细胞移植组,干细胞移植组外周血调节性T细胞阳性率低于正常对照组(P <0.01);④模型对照组和磷酸盐缓冲液对照组的脾脏树突状细胞阳性率低于正常对照组和干细胞移植组(P <0.01);⑤模型对照组、磷酸盐缓冲液对照组和干细胞移植组的Th2比例高于正常对照组(P <0.05);模型对照组和磷酸盐缓冲液对照组的Th1比例和Th1/Th2比值低于正常对照组和干细胞移植组(P <0.05);⑥与正常对照组比较,模型对照组和磷酸盐缓冲液对照组外周血中白细胞介素2、干扰素γ、白细胞介素10和T淋巴细胞产生的淋巴毒素水平降低,白细胞介素4水平升高(P <0.05);与模型对照组和磷酸盐缓冲液对照组比较,干细胞移植组外周血中白细胞介素2、白细胞介素10、干扰素γ和T淋巴细胞产生的淋巴毒素水平升高,白细胞介素4水平降低(P <0.05)。结果表明脂肪间充质干细胞移植可通过提高树突状细胞和调节性T细胞比例、促进辅助性T细胞亚型的转化对系统性红斑狼疮小鼠免疫功能产生影响。

变应性鼻炎小鼠模型中Helios^+ Foxp3^+ CD4^+T细胞比例变化及意义

目的探讨Helios^+Foxp3^+CD4^+T细胞在变应性鼻炎(AR)鼠模型中比例及意义。方法 8只Balb/c小鼠随机分为两组,每组4只。先后给予卵清蛋白(OVA)腹腔注射和OVA生理盐水滴鼻构建变应性鼻炎鼠模型作为AR组,对照组采用生理盐水替代OVA行腹腔注射和滴鼻。取两组小鼠脾组织,通过流式细胞术检测两组小鼠脾组织中Helios^+Foxp3^+CD4^+T细胞的比例。结果在AR组与对照组小鼠脾组织中均检测到Helios^+Foxp3^+CD4^+T细胞,并且AR组中Helios^+Foxp3^+CD4^+T细胞比例显著低于对照组[(13. 55±0. 71)%vs (16. 73±0. 75)%,P <0. 01]。结论 AR免疫调节机制中,Helios^+Foxp3^+CD4^+T细胞可能具有负性调节作用,明确变应性鼻炎Heli-os^+Foxp3^+CD4^+T细胞比例,可为完善AR发病机理及免疫靶点治疗提供参考。

泡球蚴感染对小鼠脾脏CD8^+T细胞免疫功能耗竭的影响

目的观察不同时间、不同剂量泡球蚴感染对小鼠脾脏CD8^+T细胞免疫功能耗竭的影响。方法采集泡球蚴原头蚴虫体,经肝门静脉建立低(50个原头蚴)、中(500个原头蚴)和高剂量(2000个原头蚴)泡球蚴感染小鼠模型,并设生理盐水对照组。于感染后早(2周)、中(12周)、晚期(24周)分别取小鼠脾脏,研磨分离淋巴细胞。流式细胞术检测不同实验组小鼠脾脏中记忆性CD8^+T细胞表型、免疫抑制性分子2B4表达水平,及其分泌γ⁃干扰素(IFN⁃γ)、肿瘤坏死因子⁃α(TNF⁃α)、白细胞介素⁃17A(IL⁃17A)和IL⁃10的能力。结果在感染早期,高剂量泡球蚴感染诱导小鼠脾脏CD8^+T细胞以中心记忆性表型为主,其比例为(35.50±2.00)%,显著高于对照组(25.90%±2.46%)(P<0.01);在感染晚期,中、高剂量泡球蚴感染均诱导小鼠脾脏CD8^+T细胞以效应记忆性表型为主,其比例分别为(25.70±4.12)%和(28.40±4.12)%,均显著高于对照组(10.50%±6.45%)(P均<0.05)。高剂量泡球蚴感染中期和晚期,中心记忆性CD8^+T细胞比例显著低于感染早期(P均<0.01);高剂量泡球蚴感染晚期,效应记忆性CD8^+T细胞比例显著高于感染早期和中期(P均<0.05)。低、中剂量泡球蚴感染早期,脾脏CD8^+T细胞分泌IFN⁃γ和IL⁃17A能力显著增强,而高剂量泡球蚴感染虽然促进小鼠脾脏CD8^+T细胞分泌IFN⁃γ和TNF⁃α能力,但感染晚期其分泌IFN⁃γ和TNF⁃α能力显著低于早期和中期(P均<0.05)。此外,中、高剂量泡球蚴感染晚期小鼠脾脏CD8^+T细胞表面免疫抑制性分子2B4呈高表达,其比例分别为(4.73±1.56)%和(4.94±1.90)%,均显著高于低剂量组(2.49%±0.58%)和对照组(2.92%±0.60%)(P均<0.05)。结论在低、中剂量泡球蚴感染中期和晚期,机体利用自身免疫应答能力对虫体起到杀伤和清除;而高剂量泡球蚴感染晚期可诱导小鼠脾脏CD8^+T细胞上调2B4分子表达,导致免疫耗竭,造成慢性寄生。

创伤弧菌溶细胞素对小鼠脾脏和肺脏T细胞细胞毒活性的差异性影响

目的：研究重组创伤弧菌溶细胞素（ rVvhA）对小鼠脾脏和肺脏T细胞亚群细胞毒活性作用及其组织差异性，了解其对脾脏和肺脏CD4^＋初始T细胞和效应T细胞存活率的影响。方法利用大肠杆菌表达系统重组表达创伤弧菌溶细胞素（rVvhA），体外作用于C57BL/6小鼠的脾脏和肺脏单细胞悬液，采用流式细胞术结合CD45.2、CD4、CD8、CD44、CD62L和Live/Dead等荧光抗体（或探针）检测分析rVvhA对CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞的存活率及组织差异性的影响。结果 rVvhA体外作用于脾脏和肺脏的单细胞悬液6 h后，小鼠脾脏CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞的存活率下降且CD4^＋T细胞对rVvhA的细胞毒性更为敏感，小鼠肺脏CD4^＋T细胞存活率轻微下降而CD8^＋T细胞的存活率无明显变化，此外，脾脏CD4^＋初始T细胞和效应T细胞的存活率均下降，而肺脏CD4^＋初始T细胞和效应T细胞的存活率均未有明显下降。结论 rVvhA对脾脏和肺脏T细胞亚群细胞毒活性存在组织差异性，而这种差异性可能与组织间的CD4^＋初始T细胞有关。