牛副流感3型病毒Nano-PCR、LAMP方法的建立及初步应用

试验旨在建立牛副流感3型病毒(bovine parainfluenza type-3 virus,BPIV3)纳米PCR(Nano-PCR)与环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)新型快速分子检测技术,对其进行特异性和敏感性对比试验,并对10份临床样品进行了检测。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR和LAMP方法只对BPIV3特异,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒无交叉反应;建立的Nano-PCR和LAMP方法具有相同的敏感性,均是普通PCR的10倍,最低核酸检出量均为4.16×102拷贝/μL。临床检测结果显示,建立的两种方法阳性符合率为100%,且阳性检出率均高于普通PCR。因此,本试验建立的Nano-PCR和LAMP方法为BPIV3的临床诊断提供了更快速、敏感、可靠的工具。

牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR与LAMP及PCR检测方法的对比研究

本研究应用金纳米颗粒与PCR结合建立了牛传染性鼻气管炎病毒(BoHV-1)纳米PCR(nanoPCR)新型检测方法和LAMP可视化检测方法,并与普通PCR方法进行对比研究。建立的BoHV-1纳米PCR新型分子检测方法和LAMP方法,特异性良好,敏感性与LAMP方法和常规PCR对比结果显示,nano-PCR方法敏感性是LAMP和普通PCR的10倍,最低检出量为2.23×102copies/L,是普通PCR的100倍;LAMP样品检测用时最短,50 min即可得到检测结果。临床样品的阳性检出率nano-PCR方法最高,检出阳性样品8/10份(弱阳性1份),普通PCR阳性检出率最低,检出阳性样品3/10份,LAMP检出6/10份。结果表明,nano-PCR敏感性和特异性更适合于临床样品的检测。

牛病毒性腹泻病毒Nano-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的分子检测方法,本研究利用金纳米颗粒材料与传统PCR技术相结合,针对BVDV 5′UTR保守序列设计引物,建立了BVDV Nano-PCR新型分子检测方法,并与RT-PCR及商品化IDEXX试剂盒BVDV抗原检测方法分别对临床样品进行对比研究。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR只对BVDV特异,而对牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛副流感3型病毒（BPIV3）均无交叉反应;Nano-PCR敏感性是普通PCR的10倍,最低核酸检测量为6.84×10~2copies/L。临床检测结果显示,建立的Nano-PCR方法对38份临床样品的阳性检出率为34.21%,是RT-PCR的2.6倍,是IDEXX试剂盒的1.5倍。本研究结果表明,建立的BVDV Nano-PCR方法可以用来对临床样品进行快速诊断和鉴定,具有特异性高、灵敏度好、快速稳定的优点。

牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒及牛支原体三重Nano-PCR方法的建立与初步应用

为了同时检测临床上牛常见的三种呼吸道重要病原体,本研究针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛支原体(MB)保守基因进行引物设计,并成功构建标准阳性质粒。使用纳米金颗粒将普通PCR方法优化,建立了三重Nano-PCR检测方法。结果显示,三重Nano-PCR检测方法可同时检测出BVDV、IBRV和MB的阳性质粒(1μL)最低检测分别为1 fg、100 ag、10 fg,灵敏度分别为常规PCR的10、10、100倍。临床结果显示,30份采集于临床呼吸道病牛样品中,BVDV、IBRV和MB的Nano-PCR的检测阳性率分别为33.33%、36.67%、33.33%,而普通PCR的检测阳性率分别为26.67%、30%、20%,提示BVDV和IBRV混合感染最多,阳性率可达26.67%。三重Nano-PCR方法特异性良好,检测其他牛呼吸道相关病原体BCV、BPIV3和BRV时结果均呈阴性。本研究建立的快速灵敏且特异良好的三重Nano-PCR检测方法可广泛应用于临床诊断和流行病学筛查。

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重Nano-PCR检测方法的建立与应用

为了对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)同时进行检测,提高检测效率,根据IBRV gE基因序列(GenBank登录号:L27212.1)和BVDV 5′端非编码区序列(GenBank登录号:AY-278459.1)的保守区域,分别设计1对IBRV的特异性引物和1对BVDV的特异性引物,建立用于IBRV和BVDV的双重纳米PCR(Nano-PCR)检测方法。特异性试验结果显示,该方法对牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒均无交叉反应,表明该方法的特异性良好。敏感性试验结果显示,该方法的最低检测量为10 fg/μL,是普通PCR的10倍,表明该方法的敏感性良好。特异性试验与敏感性试验均进行3次重复,结果一致,重复性良好。用建立的方法对38份临床样品进行检测,IBRV、BVDV及IBRV与BVDV的共感染阳性率分别为5.26%、44.74%和2.63%。综上所述,建立的Nano-PCR方法可用来对临床样品的快速诊断和检测,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点。

鹅星状病毒和鹅坦布苏病毒双重nano-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断鹅星状病毒(GoAstV)和鹅坦布苏病毒(TMUV),本研究根据GenBank上公布的GoAstV和TMUV基因保守区设计了2对特异性引物,结合金纳米材料,通过对反应条件的优化,建立了一种可同时检测这两种病毒的双重nano-PCR诊断方法。结果显示,该方法对鹅细小病毒(GPV)、鹅圆环病毒(GoCV)、新城疫病毒(NDV)和禽腺病毒(FAdV)这4种鹅常见病毒的扩增结果均为阴性。该方法对GoAstV和TMUV的最低检测浓度分别为1.21×10^(1) copies/μL和1.21×10^(3) copies/μL,敏感性较普通PCR分别高100倍和10倍。对42份临床样品的检测结果显示,共检出GoAstV 13份,TMUV 1份。上述结果表明,本研究建立的双重nano-PCR方法快速、特异、敏感,可用于鹅星状病毒和鹅坦布苏病毒的临床检测和流行病学调查。

不同生物活性基团修饰的纳米磁珠在核酸提取中的效能比较

目的评价不同生物活性基团修饰的纳米磁珠核酸提取效能,为临床应用及结果评价提供一些依据。方法通过不同生物活性基团修饰的纳米磁珠对检测乙型肝炎病毒的标本进行核酸提取,采用微量分光光度计(NanoDrop One~c)检测核酸的浓度及纯度,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测样本的CT值。结果在几种纳米磁珠提取法中,超顺磁性羧基纳米微粒提取的核酸浓度及纯度最高(浓度平均为953.3 IU/mL),其次是二氧化硅磁性微球与羧基微球混合纳米磁珠及纳米磁性氧化物MnFe_(2)O_(4)提取法。羟基修饰二氧化硅颗粒以及壳聚糖包覆的磁珠提取的核酸浓度较高,但纯度较差(A260/280及A260/230比值均超出标准范围)。对于同一样本,超顺磁性羧基纳米微粒提取的核酸扩增CT值为(21.28±0.36),核酸提取效率明显高于离心柱提取法,且具有统计学意义。二氧化硅磁性微球和羧基微球混合纳米磁珠、羟基修饰二氧化硅纳米磁珠及壳聚糖包覆的纳米磁珠核酸提取效率均低于离心柱提取法。此外,超顺磁性羧基纳米微粒的提取时间可缩短至15分钟。结论超顺磁性羧基纳米微粒核酸提取效率、精密度及核酸产物纯度最高,有较大的临床应用价值。

毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌双重PCR检测方法的建立

旨在初步建立可同时检测毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的双重PCR及纳米PCR检测方法。基于E.necatrix的ITS-2基因和C.perfringens的α毒素基因分别设计、筛选靶基因位点的特异性扩增引物,通过反应体系和退火温度的优化,建立适用于两种病原的特异性双重PCR和双重纳米PCR检测方法;用所建立的方法对6种其它常见寄生性原虫和3种其他细菌进行PCR扩增以验证其特异性;构建两种病原的重组质粒pMD19-T-ITS2和pMD19-T-cpa,将其按10倍倍比稀释成不同浓度梯度的质粒模板用于所建方法的敏感性试验。结果表明:两种方法均能特异性扩增出E.necatrix约150 bp和C.perfringens约400 bp的目的片段,且所建立的两种检测方法对其他6种其他原虫和3种其他细菌的检测结果均为阴性;双重PCR扩增E.necatrix和C.perfringens的最低模板检出量分别是181和1050 copies,而双重纳米PCR的最低模板检出量分别是1.81和105 copies;临床检测结果显示,所建立的2种方法与临床病原学检测结果一致。成功建立了用于E.necatrix和C.perfringens双重PCR和双重纳米PCR检测方法,且敏感性好、特异性高,可为临床上毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌感染的检测提供技术支持。

胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测方法,本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4(APxⅣ)序列合成特异性引物,通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示,该纳米PCR对APP的检测下限为1×10^(2)CFU/mL,其灵敏度是普通PCR的10倍;特异性结果显示,该方法仅从APP核酸样品可检测到约417 bp的特异性目的条带,而对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门菌、金色葡萄球菌等其他病原的检测结果均为阴性;应用本研究建立的纳米PCR技术检测了41份临床疑似APP感染病料,结果显示常规PCR和纳米PCR检测APP阳性率分别为17.07%(7/41)和19.51%(8/41)。以上结果表明,本研究成功建立的APP纳米PCR检测方法敏感性高、特异性好,可用于APP感染的临床诊断及流行病学调查。

禽流感病毒H7和N2亚型nano-dPCR检测方法的建立和应用

为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法,从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列,采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物,通过对nano-dPCR反应条件进行优化确定最佳反应体系;利用优化好的反应体系开展nano-dPCR方法的特异性和敏感性试验;采集活禽市场家禽咽喉及泄殖腔拭子样品进行临床样品检测并进行验证。结果表明,成功建立了一种同时检测H7亚型(723 bp)和N2亚型(314 bp)AIV的nano-dPCR方法,该方法特异性良好,其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性的条带,H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量分别达到了5×103、5×103拷贝/μL,其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍,其对临床样品检测结果准确率达到100%,可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。

犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异性和灵敏性良好,最低核酸检出量为2拷贝·μL^-1,其敏感性比常规PCR高1000倍。分别采用纳米PCR和常规PCR,对广西、北京、吉林送检的75份疑似CPV的临床样品进行检测,CPV阳性率分别为89.3%(67/75)和70.7%(53/75),表明该方法具有更高的敏感性,适用于CPV低含量临床样品的检测。本方法的建立为CPV感染的早期快速、灵敏、准确的诊断提供了新方法,为CPV的防控奠定基础,具有重大的临床应用意义和价值。

胞内劳森菌的纳米PCR检测方法的建立

为建立一种猪增生性肠炎(PPE)的快速诊断方法,本研究根据Gen Bank中已登录的胞内劳森菌(LI)基因组16S rDNA基因序列,设计1对引物,以疑似PPE的病料样品,通过PK-15细胞培养,分离到一株LI,建立了LI的纳米金PCR检测方法。结果表明该方法能够扩增得到与实验设计相符的202 bp(LI)的特异性片段;与大肠杆菌、沙门氏菌、流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒无交叉反应,特异性良好。与普通PCR法进行比较,该方法检测灵敏度比普通PCR高100倍。经临床检测,从50份病料样品中检出5份阳性样品,并且发现回肠粘膜和粪便中LI的检出率明显高于组织中LI的检出率。该方法可以用于LI的临床快速检测与流行病学调查。本研究为进一步研究LI的人工培养和实验室诊断PPE奠定了基础。

罗氏LightCycler Nano荧光定量PCR仪性能评价

目的对美国罗氏公司LightCycler Nano 32孔荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪的主要性能指标进行评价。方法按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的评价标准,评价仪器精密度、准确度、灵敏度、可报告范围、仪器间比对等指标。结果LightCycler Nano精密度批内变异系数(CV)为2.63%、1.51%,批间CV为6.2%、4.15%;准确度与室间质控物比较,5个标本均在靶值区间内;灵敏度检测CV≤10%;可报告范围为最大稀释比例1∶100;与比对仪器的比对结果偏差结果均小于15%。结论罗氏LightCycler Nano荧光定量PCR仪5项性能经验证后与厂家提供的性能参数相符,可以用于临床检测。

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测试剂盒的研制及应用

为研制一种高效、快捷、灵敏的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)检测试剂盒,本研究根据FAdV-4的保守序列设计了一对引物及探针,并在下游引物标记FITC,探针标记Biotin,应用纳米PCR技术结合横向流动试纸条技术(LFD),优化反应及杂交条件后建立了检测FAdV-4的纳米PCR-LFD方法,并组装了FAdV-4纳米PCR检测试剂盒。同时对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性、稳定性、保存期评估等试验及临床样品检测。特异性试验表明,此试剂盒能够特异性检测出FAdV-4,而对于禽的其他主要病毒性及细菌性病原如鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡马立克病病毒(MDV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭瘟病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒H9亚型(AIV(H9))、禽呼肠孤病毒(ARV)、FAdV标准株(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11)、鸡大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(SA)、鸡白痢沙门氏菌(SP)、鸡毒支原体(MG)的检测结果均为阴性。敏感性试验表明,此试剂盒的敏感性比常规PCR方法敏感10倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到56.0拷贝/μL。试剂盒的批内、批间检测结果具有良好的一致性和稳定性。稳定性试验结果说明试剂盒至少可以耐受20次的反复冻融,依然有很好的检测效果。保存期试验证实,试剂盒在4℃条件下至少可以保存3个月,在-20℃条件下至少可保存12个月。此试剂盒实现了对FAdV-4检测结果的可视化,简化了操作流程,提高了检测效率。对天津及周边地区临床送检的117份样品检测结果显示,FAdV-4阳性率为17.95%(21/117)。本试验研制的试剂盒可用于FAdV-4的临床诊断和分子流行病学调查,对养禽场FAdV-4感染的早期检测与制定综合防控措施提供了重要的技术支撑。

甜樱桃病毒病分子检测技术的研究

【目的】建立简便、快速、高效、准确的甜樱桃病毒分子检测方法。【方法】根据我国甜樱桃病毒病害的发生特点,先后建立和完善了几种主要病毒的单重RT-PCR、多重RT-PCR、纳米磁珠技术结合多重RT-PCR的检测方法,并对各检测方法的适用范围、检测效率进行比较分析。【结果】改进后的单重RT-PCR方法利用随机引物反转录得到的c DNA模板可同时用于多种病毒的特异性检测。多重RT-PCR方法可在同一管PCR反应中同时检测多种病毒。运用纳米磁珠技术结合多重RT-PCR的检测方法在植物病毒核酸提取环节简化了操作程序。【结论】该检测技术体系已应用于山东地区甜樱桃及中国樱桃等大批量植物样本的病毒检测工作之中,检测结果稳定、可靠。

PCV2和PCV3双重纳米PCR方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重纳米PCR(nanodPCR)方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano-dPCR的反应条件进行优化;同时考察所建立的nano-dPCR检测方法的特异性和敏感性。结果显示,所建方法的特异性和敏感性良好,对PCV2和PCV3两种病毒的最低核酸检测量分别为93.2和91.6拷贝/μL,其敏感性比普通PCR高100倍。应用该方法对送检的265份临床样本进行检测,结果显示,PCV2和PCV3在猪群中存在普遍感染,PCV3和PCV2的阳性率分别为16.6%和14.7%,混合感染阳性率为6.8%。临床样品的检测结果表明,本试验建立的nano-dPCR方法为PCV2和PCV3早期感染进行快速、敏感鉴别诊断提供了新方法。

纳米羟磷灰石/聚酰胺66对成骨细胞生物学作用的实验研究

目的研究新型纳米根管充填材料纳米羟磷灰石/聚酰胺66(nHA_PA66)对成骨细胞的生物学作用。方法以含nHA_PA66的细胞培养基(DMEM)浸提液作用于实验组细胞,DMEM培养基作用于对照组细胞,采用MTT比色法检测nHA_PA66对成骨细胞生长的影响;酶联法检测细胞ALP活性的变化;QRT_PCR测量细胞骨钙素基因表达的变化。结果实验组细胞的相对增殖率在98%～106%之间,且无量效关系,实验组与对照组间无显著性差异(P>0.05);实验组和对照组细胞的ALP活性及骨钙素基因表达相似,皆无显著性差异(P>0.05)。结论nHA_PA66对成骨细胞的生长和功能无不良影响,具有骨细胞相容性。

不同粒径二氧化硅粉尘对大鼠肺组织中LIGHT基因表达影响的比较研究

目的:观察微米级二氧化硅(μm-SiO2)和纳米级二氧化硅(nm-SiO2)粉尘对大鼠肺组织中LIGHT基因表达水平的影响。方法:56只雄性Wistar大鼠随机分7组,即nm-SiO2、μm-SiO2各分设10 mg/100 g、15 mg/100 g、20 mg/100 g 3个剂量组和1个对照组;采用气管滴注法对实验组滴注相应剂量的二氧化硅悬液,对照组滴注生理盐水,1次/d,连续2周;造模结束后左心室放血处死,利用RT-PCR方法研究染毒大鼠肺组织中LIGHT基因表达水平的变化。结果:微米实验组大鼠肺组织中LIGHT基因的表达水平增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);纳米实验组大鼠肺组织中LIGHT基因的表达水平增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),且高于微米组(P<0.05)。结论:炎症早期,LIGHT基因在μm-SiO2和nm-SiO2实验组中表达均增高;二氧化硅粒径越小,LIGHT基因的表达量越高。

吉林省牛病毒性腹泻病毒流行病学调查分析

为了解吉林省牛病毒性腹泻的流行情况,试验采用纳米PCR检测技术和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体ELISA检测试剂盒对吉林省部分省界地区BVDV进行病原和血清抗体流行病学调查。对BVDV 5′-UTR扩增,对扩增出的部分序列进行测序,构建系统遗传进化树。结果表明:在635份血清样品中,ELISA检测抗体阳性397份,阳性率为62.52%。对血清样品及临床组织病料采用纳米PCR方法进行检测,共检测出150份阳性样品(其中血清122份、临床组织病料28份),BVDV阳性率为19.21%。在辽宁省省界地区(四平市、梨树县、东丰县、梅河口市)的BVDV血清抗体阳性率较高,吉林市、丰满区较低。吉林省北部的宁江区、扶余市、榆树市及南部地区的东丰县、柳河县的BVDV抗原阳性率高于东部延边州地区(敦化市、延吉市)及西部地区(白城市),中部地区(吉林市、丰满区)的BVDV抗原阳性率较高。对10份阳性样品的PCR产物进行测序分析,结果牛群中流行毒株均为BVDV 1型,与BVDV JL-1株同源性最高,为吉林省主要流行强毒株。说明吉林省检测地区都存在不同程度的BVDV感染情况。