基于纳米抗体-荧光素酶的黄曲霉毒素B1检测方法构建

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种剧毒、致癌的食源性污染物,严重威胁食品安全和公共健康。为开发快速检测AFB1的生物发光酶联免疫分析(BLEIA)方法,系统测试了3种抗AFB1特异性纳米抗体(NB)与纳米荧光素酶(Nluc)融合蛋白(G8-Nluc、Nluc-NB26和Nluc-NB28)的可溶性表达、纯化情况及酶催化活性。基于3种融合蛋白分别建立BLEIA检测体系,选择Nluc-NB26用于谷物样品的分析和验证。结果表明,Nluc-NB26的可溶性表达量最高,稳定性更好,Nluc-NB28的可溶性表达量次之,而G8-Nluc基本不可溶。不同表面活性剂对G8-Nluc的促溶解性研究表明,添加N-月桂酰肌氨酸钠可显著提高其溶解度,纯化得到的3种融合蛋白均具有良好的酶活性及抗原结合活性。基于融合蛋白的BLEIA检测结果显示,Nluc-NB28-BLEIA、G8-Nluc-BLEIA和Nluc-NB26-BLEIA体系检测AFB1的IC_(50)值分别为4.213,1.697,2.169 ng/mL,表明G8-Nluc-BLEIA体系的灵敏度最高,Nluc-NB26-BLEIA与前者接近,Nluc-NB28-BLEIA最低。综合考虑融合蛋白的可溶性表达量、稳定性及检测性能,对Nluc-NB26-BLEIA开展实际样品的分析和验证,结果表明:这一方法检测谷物中AFB1的平均回收率在91.1%~104.1%之间,与商业化酶联免疫吸附测定试剂盒结果相似,而检测的时间和试剂成本明显降低。研究结果为开发快速、高灵敏的AFB1检测技术提供参考。

实时荧光环介导等温扩增快速检测黄曲霉毒素产生菌方法的建立

黄曲霉毒素是一种具备强致肝损伤性、致癌性和致畸性的微生物毒素。根据产黄曲霉毒素调节基因aflR、柄曲霉素转甲基酶基因omt-1、杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1分别对实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物进行设计,对其建立并优化LAMP体系。结果显示,该文所建立的方法针对aflR、omt-1、ver-1基因设计的引物,黄曲霉菌DNA的检出限分别是1.0×10^(-2)、1.0×10^(-3)、1.0×10^(-4) ng/μL。此体系与黄曲霉及寄生曲霉反应成阳性,与其他菌体反应皆为阴性,该方法耗时短、设备要求低,借助恒温荧光读取设备或根据显色剂颜色变化可在60 min内迅速判定待检菌株是否为黄曲霉毒素产生菌,可满足各机构现场快速高效检测的需要。

基于化学激活荧光素酶表达基因法和标准方法评估动物源性固态食品中17种二噁英类化合物毒性当量的相关性比较

为使化学激活荧光素酶表达基因法(CALUX)在动物源性固态食品中二噁英类化合物毒性当量筛查中具有更好的适用性,使其能够与标准方法高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC-HRGC)的评估结果相互转换,分别基于CALUX和HRGC-HRGC评估了肉类、海鲜类和配方乳粉这3类典型动物源性固态食品中7种2,3,7,8-取代的多氯代二苯并二噁英(PCDDs)和10种2,3,7,8-取代的多氯代二苯并呋喃(PCDFs)的毒性当量,分析两种方法测定结果的相关性,并确定换算关系和适宜样品类型。结果表明:基于HRGC-HRMS得到的样品中17种目标物的毒性当量(TEQ)下限值为0.001~0.106 pg·g^(-1),TEQ上限值为0.004~0.242 pg·g^(-1),远低于欧盟法规EC 1881/2006规定的限量值(3.5 pg·g^(-1));基于CALUX得到的肉类样品中17种目标物的毒性当量(BEQ)值为0.74~1.30 pg·g^(-1),海鲜类样品中17种目标物的BEQ值为0.31~0.63 pg·g^(-1),配方乳粉样品中17种目标物的BEQ值为0.043~0.074 pg·g^(-1);肉类和配方乳粉样品的BEQ值与TEQ值的相关性较差,而海鲜类样品的BEQ值与TEQ上限值相关性较好。

稳定表达Cas9蛋白质、荧光蛋白质和荧光素酶的胰腺癌细胞株的建立及鉴定

目的构建Cas9蛋白质、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质、荧光素酶-红色荧光蛋白质稳定表达的人和小鼠胰腺癌细胞株,并验证荧光素酶的活性和Cas9的基因编辑功能,以便利用荧光素酶和CRISPR/Cas9系统开展胰腺癌的研究。方法在人胰腺癌细胞系(AsPC-1、CFPAC-1、HPAC、BxPC-3、HS 766T、MIA PaCa-2、PANC-1和SW 1990)、小鼠胰腺癌细胞系(Pan02)中,感染Cas9表达质粒pLv-EF1α-Cas9m1.1-Puro,挑选单细胞克隆培养扩增,提取总蛋白质后,Western blot验证Cas9的表达水平;感染荧光蛋白质表达质粒pLv-EF1α-EGFP、pLv-EF1α-mCherry、pLv-EF1α-tdTomato、pLv-EF1α-Luc2-tdT,荧光显微镜下挑选荧光蛋白质稳定表达的单克隆培养扩增;选取每种细胞Cas9稳定表达的一个克隆感染pLv-EF1α-Luc2-tdT,荧光显微镜下挑选荧光蛋白质稳定表达的单克隆培养扩增;选取其中2个细胞株感染Lv-EF1a-mCherry,流式细胞术分选出mCherry阳性的细胞,再通过慢病毒感染靶向mCherry基因的向导RNA,细胞扩增后,通过荧光显微镜下观察和流式细胞术检测mCherry被敲除的情况;5只BALB/c Nude小鼠皮下接种MIA PaCa-2-Luc2-tdT细胞(1.0×10^(7)个/只),36 d后活体成像。结果筛选到48个Cas9稳定表达的胰腺癌细胞株(其中表达Cas9m1.1的细胞23株,表达Cas9m1.1-Luc2-tdT的细胞25株),筛选到33个荧光蛋白质稳定表达的胰腺癌细胞株(表达EGFP的细胞8株,表达mCherry的7株,表达Luc2-tdT和tdTomato的各9株)。表达mCherry和Cas9的细胞感染mCherry gRNA后,mCherry被敲除。活体成像显示,表达Luc2-tdT的MIA PaCa-2细胞生物发光和荧光发光均存在。结论成功建立了33个荧光蛋白质稳定表达的人和小鼠胰腺癌细胞株,其中表达Luc2-tdT的细胞株具有荧光素酶活性;成功建立了48个Cas9稳定表达的人和小鼠胰腺癌细胞株,Cas9具有基因编辑活性,基因编辑活性因原始细胞系不同而存在差异。

牦牛KSR2基因的双荧光素酶质粒构建及其与bta-miR-22-3p的靶向验证

为了鉴定牦牛体内bta-miR-22-3p与KSR2之间的靶向关系,本研究采用miRNA Base数据库对牦牛体内bta-miR-22-3p的序列进行分析,并用Target scan软件预测牦牛bta-miR-22-3p于KSR2基因的3’UT R可能存在的结合位点,然后采用PCR扩增出包含bta-miR-22-3p结合位点的牦牛KSR2基因3'非编码区(3’UTR)片段,并构建出KSR2基因的3’UTR的野生型双荧光素酶报告基因质粒和突变型双荧光素酶报告基因质粒,并将其与bta-miR-22-3p mimics、mimics NC共转染至人胚肾细胞(HEK 293T细胞)中,检测其双荧光素酶活性。miRNA Base数据库中bta-miR-22-3p的序列为AAGCUGCCAGUUGAAGAACU G;Target scan预测出bta-miR-22-3p共有包括KSR2基因在内的568个潜在靶基因,其中包括612个保守位点和190个低保守位点,并且在KSR2基因3’UTR的829-836 bp处存在潜在的bta-miR-22-3p的结合位点;构建的野生型质粒和突变型质粒经双酶切后释放出大小315 bp的条带,测序结果与预期一致,说明质粒构建成功;bta-miR-22-3p mimics能够显著降低(P<0.01)KSR2野生型质粒双荧光素酶的活性。最终说明,牦牛KSR2基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并且该基因与bta-miR-22-3p存在靶向关系。

荧光素酶研究进展

荧光素酶 (Luciferase)可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。萤火虫荧光素酶是分子量为 60～ 64kD的多肽链 ,在Mg2 +、ATP、O2 存在时 ,催化D 荧光素 (D Luciferin)氧化脱羧 ,发出光 (λ =5 5 0～ 5 80nm)。细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的加单氧酶 ,它催化长链脂肪醛、FMNH2 和O2 的氧化反应 ,发出绿蓝光 (λ =490nm)。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶可分别从萤火虫和发光细菌中直接提前 ,亦可用基因工程的方法进行生产。荧光素酶催化的发光反应能用生物发光检测仪进行灵敏、快速检测 ,因此该酶有多方面的用途 ,如应用于快速检测、报告基因分析。

虫荧光素酶报告基因用于二噁英类化学物质的检测

虫萤光素酶报告基因检测二英类化学物质与传统的EROD法比较 ,灵敏度及线性范围均优于EROD法 ,并且检测时间缩短 ,操作简便。

荧光素酶报告基因在转基因蚕中的应用

报道了在针对BmNPV的核酶转基因蚕筛选过程中利用荧光素酶报告基因的检测及鉴定结果。试验采用的质粒为含家蚕核多角体病毒(BmNPV)的即刻早期蛋白基因IE启动子荧光素酶(Luciferase)报告基因———抗NPVIE核酶基因的联合重组质粒pIELucRz。该质粒经限制性内切酶ScaⅠ线性化后,用基因枪法导入家蚕早期受精卵(G0),待G1代测定荧光素酶活性表达较高的蚕的羽化交配产卵,分别于G2、G3和G4代再用BmNPV接种筛选出对NPV抗性较高的蚕继代。其中G4代转基因蚕基因组DNA经PCR测定及Southern杂交分析显示,荧光素酶基因已插入家蚕基因组DNA,并以多拷贝形式存在。这表明荧光素酶基因是转基因蚕研究有效的报告基因之一。

荧光素酶报告基因法测定废气中二噁英类物质

研究二噁英类生物检测法的主要目的是简化二噁英类分析流程,并找出快速检测的结果与HRGC-HRMS(高分辨气相色谱-高分辨质谱)结果之间的换算系数,从而可以利用快速检测的结果和换算系数来推算HRGC-HRMS的结果.介绍了CALUX(荧光素酶报告基因法)分析废气中二噁英类物质的原理,并采用该方法分析了我国27个废气样品,以期找出其测定结果与HRGC-HRMS结果之间的换算系数.结果表明,这2种测试方法数据相关性显著,R2为0.994 8,数据间的换算系数为0.379.试验表明,CALUX法具有很好的推广性,如果再适当增加废气样品的数量,对换算系数进行适当的优化,则所得换算系数可推广.

红色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因转基因小鼠的建立

背景与目的:活体动物体内光学成像(optical in vivo imaging)主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记,利用一套非常灵敏的光学检测仪器,能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为,生物发光成像具有高的灵敏度和特异性,同时生物发光信号可用于精确定量,而荧光成像具有方便、便宜、直观、标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点。本研究基于慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和Luc双报告基因转基因小鼠(即RL转基因小鼠),将这两种技术融为一体。方法:制备携带RFP和Luc基因(简写RL基因)的慢病毒,然后将携带RL基因的慢病毒注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定,并获得RL转基因小鼠。结果:移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎125枚给6只假孕母鼠,其中4只假孕母鼠怀孕,共生仔鼠20只;利用小动物活体成像仪检测RFP和Luc表达,在蛋白水平证实20只F0代中,3只高表达RFP和Luc;DNA水平检测证实,3只RFP和Luc阳性的小鼠基因组中确实整合有外源转基因RL,预示基因型鉴定结果很好验证了小动物活体成像仪筛选和鉴定结果。此外,RL转基因首建鼠基因组中整合的RL转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。RL转基因小鼠主要脏器均可见红色荧光和Luc信号,但不同脏器间荧光和Luc强度有差异。结论:成功制备RL双报告基因转基因小鼠,为后续研究干细胞在肿瘤发生、发展和转移中的作用和造血重构等提供双报告基因标记的各种移植用供体细胞,并对此供体细胞及其在体内衍生的细胞进行灵敏的非损伤、实时可视化体内跟踪。

热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用

新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。

两种根癌土壤杆菌介导的荧光素酶在植物体内表达分析

根据报道的荧光素酶(Luciferase,Luc)基因设计引物,PCR扩增获得Luc基因,经BamH I和PstI酶切连接到载体pCHF3上,成功构建植物表达载体pCHF3-Luc.将pCHF3-Luc分别转入根癌土壤杆菌株EHA105和LBA4404细胞内,利用根癌土壤杆菌渗入法导入本氏烟和大麦,荧光检测仪内检测本氏烟和大麦叶片中瞬时表达的Luc活性.结果表明:两种根癌土壤杆菌介导的Luc可以在本氏烟中成功表达,而在大麦中不能表达;利用根癌土壤杆菌渗入法在本氏烟中表达外源基因时,EHA105菌株优于LBA4404菌株.

检测miRNA活性的双荧光素酶单载体

本研究报道了微小RNA靶分子鉴定及其活性分析的内参内置型双荧光素酶单载体与其应用.利用非连接酶依赖的基因克隆技术,借助一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法,将萤火虫荧光素酶基因(Firefly luc)融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因(Renillaluc)和氨苄青霉素抗性基因之间,构建为两种荧光素酶基因表达框并置的单载体报告系统,命名为pMiSensor.在海肾荧光素酶基因的3'非翻译区引入多克隆位点Xba I和Apa I,便于克隆目的基因的3'UTR.海肾荧光素酶为报告基因,萤火虫荧光素酶为内参基因.多种哺乳动物细胞系的转染实验证实,pMiSensor可同时有效表达两种报告基因,其酶活显示出宽广的线性范围.通过构建pMiSensor-CCNE1报告载体,证明pMiSensor能够重现miR16对细胞周期蛋白CCNE1的调控作用.通过转染miR16抑制剂,证明pMiSensor-CCNE1可作为一种灵敏的生物感应器,探测细胞内微小RNA的活性变化.该双荧光素酶单载体具有重复性高、操作简便、定量准确的优点,适用于微小RNA靶分子的筛选、鉴定和确认,也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化.

一种新型双荧光素酶报告基因表达载体的构建

目的:构建一种新型的双荧光素酶报告基因表达载体。方法:设计并扩增海肾荧光素酶基因hRLUC,将其插入到双酶切的含有萤火虫荧光素酶报告基因(Firefly)的载体pGL4.10中,得到pGL4.10-hRLUC;使用lipofectamine3000将pGL4.10和pGL4.10-hRLUC分别转染入HEK293细胞,检测细胞中荧光素酶活性,以未转染细胞作对照。结果:使用PCR方法获得hRLUC表达单元(2 350 bp);双荧光素酶报告基因表达载体pGL4.10-hRLUC经酶切和测序鉴定,插入正确。转染pGL4.10组荧光素酶活性相对值为(220.311±2.082);转染pGL4.10-hRLUC的细胞中荧光素酶活性低于pGL4.10转染细胞,高于未转染细胞(P<0.05)。结论:成功构建了双荧光素酶报告基因(hRLUC和Firefly)表达载体。

荧光素酶活体发光技术在肺癌分子影像学研究中的初步应用

目的建立稳定表达荧光素酶报告基因的人肺癌细胞系,并将该肺癌细胞接种于严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的皮下,构建异种移植动物模型,为下一步进行肺癌进展、转移以及药物敏感性等相关的分子影像学研究奠定基础。材料与方法利用表达重组荧光素酶基因的慢病毒载体(Lenti-Luc)感染人肺癌细胞系NCI-H460,获得稳定表达荧光素酶基因的肺癌细胞,将该细胞接种于SCID小鼠的皮下。肿瘤细胞接种2周后,利用生物发光成像系统及MRI对肿瘤进行检测,确定肿瘤的大小和位置,并进行组织病理学检查验证。结果接种肺癌细胞的4只SCID小鼠中,均生长出肿瘤。生物发光检测和MRI的结果相符,病理证实小鼠皮下肿块为癌组织。结论成功建立了稳定表达荧光素酶报告基因的肺癌细胞系及异种移植动物模型。荧光素酶活体发光是一种进行肿瘤分子影像学研究的重要手段。

采用双荧光素酶报告法验证乳腺癌中miR-155靶标

MiR-155与乳腺癌发生发展密切相关.本研究以乳腺癌组织和血清中均显著高表达的miR-155为研究对象,利用TargetScan和PicTar预测miR-155的靶基因.根据miR-155与靶基因结合的保守性、动力学及靶基因功能,筛选出miR-155的靶基因ACTA1(actin alpha 1,skeletal muscle)和CEBPB(CCAAT/enhancer binding protein beta),并用双荧光素酶报告法验证.将ACTA1和CEBPB的3'-UTR(3'-untranslated region)全长序列载入海肾荧光素酶基因的下游,并构建结合位点的突变序列,得到pRL-TK-Aw、pRL-TK-Am、pRL-TK-Cw、pRL-TK-Cm载体.不同海肾荧光素酶载体转染Bcap37乳腺癌细胞,同时转染miR-155及内参对照萤火虫荧光素酶载体pGL3-control.根据不同转染的海肾荧光素酶表达活性,运用SPSS软件分析,结果显示,CEBPB是miR-155在乳腺癌中的直接靶基因(P<0.05).miR-155通过下调CEBPB影响乳腺癌的发生.

荧光素酶标记的肺癌细胞系的建立及动物模型验证

目的建立一株稳定表达萤火虫荧光素酶的人肺癌细胞系并通过裸鼠成瘤模型进行验证。方法酶切并连接萤火虫荧光素酶基因到真核表达载体pRc/CMV2上构建pRc/CMV2-luc重组质粒,脂质体2000转染到肺癌细胞株A549,经G418筛选得到抗性克隆,荧光素酶活性检测筛选出荧光素酶活性最高的稳定细胞克隆。小动物活体影像系统检测确定稳定细胞克隆生物发光能力和细胞数量的关系,建立裸鼠皮下成瘤模型并分析移植瘤的发光强度和肿瘤生长的相关性。结果重组质粒pRc/CMV2-luc转染A549细胞后,经G418筛选的抗性克隆传代至40代时,确定3株荧光素酶活性较高的阳性克隆,最高的9号克隆,1×105个细胞的RLU值为9.44×105。小动物活体影像系统检测发现阳性克隆的发光强度与细胞数量呈正相关(R2=0.99);9号克隆皮下接种裸鼠形成接种瘤,其发光强度与肿瘤的生长正相关。结论成功构建了稳定表达萤火虫荧光素酶的A549细胞系,该细胞系可在小鼠活体水平动态监测其发生、发展。

中华黄萤荧光素酶的性质

近年来,萤火虫荧光素酶催化的生物发光反应被广泛的应用到ATP检测、细菌数目检测、环境监测和其他生物学研究之中。通过对中华黄萤荧光素酶的性质研究,发现其分子量为6 400左右,是一种非典型的Michaelis-Menten氏酶,对底物之一的ATP动力学曲线为S型。最适反应温度为20～25℃,对温度极其敏感,当反应温度高于30℃时,该酶的活性快速失活。该荧光素酶的最适pH=6.5。随着pH值的下降该荧光素酶生物发光的最大发射光波长没有明显的红移现象。Mg^(2+)和Mn^(2+)对该酶活性的激活效果比较接近,最佳的激活浓度均在1mmol/L附近,而Ca^(2+)最佳的激活浓度则小于1 mmol/L,且激活的效果只有Mg^(2+)作用效果的50%左右。和Hg^(2+)、Cd^(2+)等离子一样,Cu^(2+)会在一定程度上抑制该荧光素酶的活性。该酶的稳定性较差,对盐浓度和光照比较敏感,高浓度的盐类和长时间的日光照射能够使酶失活。谷胱甘肽(GSH)和二硫苏糖醇(DTT)是该酶较好的保护剂,可以提高该酶在一定时间内的稳定性,其中前者的作用效果要好于后者。

NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体的构建与鉴定

背景与目的:构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。材料与方法:以PCR法从SHEEC食管癌细胞基因组DNA中扩增NGAL基因5’侧翼转录调控区不同长度片段G0-G6(-1431-+84)。PCR产物经pGEM-Teasy转载,再定向亚克隆插入pGL3-Basic。重组子通过特异限制性内切酶切割,琼脂糖电泳予以鉴定。结果:成功构建NGAL基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体7个,pGLB-G0-G6。结论:为借助于双荧光素酶报告基因检测系统研究确定NGAL基因5’侧翼转录调控区转录调控元件的分布特点以及转录调控元件与转录调控蛋白之间相互作用的性质提供了基本实验条件。

大鼠脑胶质瘤荧光素酶动物模型建模细胞株C6-Luc的构建

目的构建稳定表达萤火虫荧光素酶的大鼠脑胶质瘤细胞株C6-Luc。方法通过浓度梯度法测定C6大鼠脑胶质瘤细胞的潮霉素最佳筛选浓度。使用FuGENEHD转染试剂将表达荧光素酶的真核质粒pGL4.50转染至C6细胞,应用潮霉素筛选多克隆细胞株,进一步采用有限稀释法筛选单克隆细胞株。采用报告基因分析对单克隆细胞株进行阳性鉴定,并考察荧光素酶在阳性克隆中表达的稳定性。对阳性克隆进行体外生物发光检测,确定最小细胞检测量,并采用线性回归分析生物发光强度与细胞数量的相关性。将阳性克隆细胞种植于Wistar大鼠脑部,应用生物发光成像检测系统对肿瘤细胞在脑部的生长进行体内监测。结果 C6细胞的潮霉素最佳筛选浓度为250μg/ml。质粒pGL4.50成功转染至C6细胞,通过潮霉素抗性筛选得到12个单克隆细胞株。通过荧光素酶报告基因分析,成功鉴定了荧光素酶表达活性最高的阳性克隆,命名为C6-Luc,连续培养3代后C6-Luc细胞表达荧光素酶的活性无显著差异。体外生物发光检测结果显示C6-Luc细胞的最小检测数量为78个,细胞发光强度(y)与细胞数量(x)呈良好的线性关系,回归方程为y=81.348x-2143.1,相关系数r=0.997。体内生物发光检测结果显示,Wistar大鼠脑部种植C6-Luc细胞后,随肿瘤体积增大,大鼠脑部的发光强度逐渐增强。结论成功构建了稳定表达荧光素酶的大鼠脑胶质瘤细胞株C6-Luc。