Evaluation of allergenic protein profiles in three Chinese high-oleic acid peanut cultivars using NanoLC-Orbitrap mass spectrometry

High oleic-acid peanuts are known for their pre-longed shelf-life and health benefit due to high content of oleic fatty acid.However,the allergenicity and allergenic protein profiles in Chinese high-oleic peanuts have yet to be studied.For this purpose,an Orbitrap Fusion mass spectrometry(MS)-based method that is feasible for identification of putative allergenic protein as well as semi-quantitation of five major allergen protein in three different Chinese high-oleic peanut cultivars(JH 13,JH 16 and JH 18)have been reported.Results show that three Chinese high-oleic acid peanut cultivars selected all contained highly allergenic proteins Ara h1,Ara h 2,Ara h 3 and Ara h 6.The allergenic protein profiles of Chinese high-oleic acid peanut cultivars were very similar to that of conventional peanuts,but the allergenic protein subunits varied greatly among higholeic peanuts.Additionally,a comprehensive peptide-filtering pipeline had been developed for identification of potential peptide markers in peanut allergen proteins.Through the peptide-filtering pipeline,three novel peptide markers,IVQIEAKPNTLVLPK,SSNPDIYNPQAGSLR and AQSENYEYLAFK surrogate to Ara h 1,Ara h 3 with high abundance,good MS response and highly reliability were identified,which can be used as candidate peptide markers for the detection of peanut allergens in different food matrices.

基于NanoLC-Orbitrap MS技术分析牛乳中的乳脂肪球膜蛋白质

运用纳升高效液相色谱与静电场轨道阱组合式高分辨质谱(Nano LC-Orbitrap MS)技术对牛乳中的乳脂肪球膜蛋白质进行定性、定量分析。采用超高速离心提取的方法,从牛乳中分离提取乳脂肪球膜蛋白,经超滤管辅助酶解法前处理,用Nano LC-Orbitrap MS技术分析酶解后的肽段,与数据库检索比对识别蛋白质,并利用PANTHER数据库对所识别的肽段匹配数≥2的蛋白质进行基因本体功能注释和分类。运用两个技术重复和3次连续进样,验证方法的重复性和精确度;从比对结果中提取部分离子流色谱图和二级质谱图,显示出质谱的高可靠性和灵敏度。采用此方法一次进样分析,可识别的蛋白质多达658种,选取识别出611种蛋白质的数据进行分析,具有可靠定量信息的蛋白593种,特异性肽段匹配数≥2的蛋白244种,对这244种蛋白进行GO注释,结果显示这些蛋白主要分布在细胞部分、细胞器、细胞膜和一些高分子复合物中,参与代谢过程、细胞过程、定位、生物调节和免疫系统过程等生物途径,具有很多的分子功能,如催化活性、粘合作用、转运活性、酶调节活性和结构分子活性等。此方法可为基于质谱技术的蛋白组学在乳脂肪球膜蛋白质的应用中提供理论指导。

i TRAQ联合NanoLC-LTQ-Orbitrap技术分析二仙汤干预去卵巢骨质疏松大鼠的骨组织差异表达蛋白

目的筛选以二仙汤干预去卵巢骨质疏松大鼠后的差异表达蛋白质,探讨二仙汤防治骨质疏松的分子作用机制。方法雌性SD大鼠,按体质量随机分为3组,即假手术组、模型组、二仙汤组,其中假手术组和模型组灌胃生理盐水,二仙汤组按生药量12 g·kg^(-1)灌胃,每日1次,连续给药90 d。取大鼠股骨,运用同位素相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)联合纳升高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱(NanoLC-LTQ-Orbitrap)高分辨质谱技术的定量蛋白质组学方法检测骨蛋白,采用ProteinDiscovery软件进行分析和鉴定差异蛋白质,通过生物信息学分析差异表达的蛋白质功能。结果质谱分析共鉴定出862个差异蛋白,其中二仙汤组与模型组相比较,共发现82个与假手术组趋势一致的差异蛋白,上调蛋白45个,下调蛋白37个。生物信息学分析发现,差异表达的蛋白大多数属于水解酶、核酸结合类蛋白、受体类蛋白等。结论细胞色素b-245轻链、促分裂原活化蛋白激酶-1、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物-1等相关差异蛋白质可能是二仙汤防治骨质疏松症的作用靶点。

新型亲和去垢小柱净化-液相色谱-串联质谱法分析水稻叶片蛋白质组

采用亲和去垢小柱净化,建立了水稻叶片蛋白质组的纳升液相色谱-串联质谱分析方法。水稻叶片蛋白质分别采用酚提取法结合十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)裂解,裂解液经亲和去垢小柱净化,酶解肽段用纳升液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱(nanoLC-LTQ/Orbitrap MS)分析,相关数据库检索鉴定。比较了超滤辅助样品制备法(FASP法)、亲和去垢小柱法和丙酮沉淀法对SDS去除效率及对蛋白质鉴定结果的影响。结果表明:3种方法均有较好的SDS去除效果(去除效率均大于95%);尽管3种方法鉴定的蛋白质种类具有一定的互补性,但以亲和去垢小柱法鉴定的蛋白质数目最多,为563种,远多于FASP法和丙酮沉淀法的196和306种;此外,亲和去垢小柱法适合于各种相对分子质量和不同pI值蛋白质的净化,而FASP法和丙酮沉淀法中不同相对分子质量和pI值蛋白质均有类似程度的损失。采用本文建立的方法,一次进样分析可鉴定出水稻叶片蛋白质多达588种;肽段匹配数≥2的296个蛋白质的生物学功能主要分为结合活性、酶活性、转移运输活性和结构组成等。该蛋白质分析方法可为开展水稻蛋白质组学研究提供技术参考。

基于纳升高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱超高分辨质谱技术研究脑心通胶囊中动物药的蛋白质

目的建立脑心通胶囊中动物药的蛋白质类成分的分析方法。方法以脑心通胶囊及其投料所用的地龙、水蛭、全蝎动物药材(分别对应通俗环毛蚓Metaphire vulgaris Chen、宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman、东亚钳蝎Mesobuthus martensii Karsch)为研究对象,采用SDS-PAGE电泳技术分离脑心通胶囊及3味动物药材的总蛋白,并进行胶内酶解,同时对脑心通胶囊和全蝎药材的总蛋白进行直接酶解;利用纳升高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱超高分辨质谱技术研究脑心通胶囊中的蛋白质。采用Proteome Discoverer软件,检索环节动物门(Annelida.fasta)和节肢动物门(Arthropoda.fasta)蛋白质数据库以鉴定蛋白质。结果在9批脑心通胶囊中有5个清晰的蛋白质条带稳定重现,其相对分子质量分别在45、40、30、25、20 kDa左右。在脑心通胶囊总蛋白中共鉴定到28个与动物药相关的蛋白质,这些蛋白质大多与细胞结构、能量代谢、物质运输有关。对胶囊SDS-PAGE中5个条带的蛋白质分别进行分析,各个条带中部分蛋白质可对应归属到3味动物药材;且新鉴定得胍乙基磷酸丝氨酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等蛋白质,前者可能与抗凝血或溶栓活性有关。结论基于超高分辨质谱技术及蛋白质组学的研究方法用于脑心通胶囊中3种动物药的蛋白质分析,本研究弥补了脑心通胶囊中蛋白类成分研究的空白,为阐明其动物药的物质基础以及进一步研究该胶囊药效与物质基础关联性提供了科学支持。