基于纳米抗体-荧光素酶的黄曲霉毒素B1检测方法构建

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种剧毒、致癌的食源性污染物,严重威胁食品安全和公共健康。为开发快速检测AFB1的生物发光酶联免疫分析(BLEIA)方法,系统测试了3种抗AFB1特异性纳米抗体(NB)与纳米荧光素酶(Nluc)融合蛋白(G8-Nluc、Nluc-NB26和Nluc-NB28)的可溶性表达、纯化情况及酶催化活性。基于3种融合蛋白分别建立BLEIA检测体系,选择Nluc-NB26用于谷物样品的分析和验证。结果表明,Nluc-NB26的可溶性表达量最高,稳定性更好,Nluc-NB28的可溶性表达量次之,而G8-Nluc基本不可溶。不同表面活性剂对G8-Nluc的促溶解性研究表明,添加N-月桂酰肌氨酸钠可显著提高其溶解度,纯化得到的3种融合蛋白均具有良好的酶活性及抗原结合活性。基于融合蛋白的BLEIA检测结果显示,Nluc-NB28-BLEIA、G8-Nluc-BLEIA和Nluc-NB26-BLEIA体系检测AFB1的IC_(50)值分别为4.213,1.697,2.169 ng/mL,表明G8-Nluc-BLEIA体系的灵敏度最高,Nluc-NB26-BLEIA与前者接近,Nluc-NB28-BLEIA最低。综合考虑融合蛋白的可溶性表达量、稳定性及检测性能,对Nluc-NB26-BLEIA开展实际样品的分析和验证,结果表明:这一方法检测谷物中AFB1的平均回收率在91.1%~104.1%之间,与商业化酶联免疫吸附测定试剂盒结果相似,而检测的时间和试剂成本明显降低。研究结果为开发快速、高灵敏的AFB1检测技术提供参考。

稳定表达Cas9蛋白质、荧光蛋白质和荧光素酶的胰腺癌细胞株的建立及鉴定

目的构建Cas9蛋白质、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质、荧光素酶-红色荧光蛋白质稳定表达的人和小鼠胰腺癌细胞株,并验证荧光素酶的活性和Cas9的基因编辑功能,以便利用荧光素酶和CRISPR/Cas9系统开展胰腺癌的研究。方法在人胰腺癌细胞系(AsPC-1、CFPAC-1、HPAC、BxPC-3、HS 766T、MIA PaCa-2、PANC-1和SW 1990)、小鼠胰腺癌细胞系(Pan02)中,感染Cas9表达质粒pLv-EF1α-Cas9m1.1-Puro,挑选单细胞克隆培养扩增,提取总蛋白质后,Western blot验证Cas9的表达水平;感染荧光蛋白质表达质粒pLv-EF1α-EGFP、pLv-EF1α-mCherry、pLv-EF1α-tdTomato、pLv-EF1α-Luc2-tdT,荧光显微镜下挑选荧光蛋白质稳定表达的单克隆培养扩增;选取每种细胞Cas9稳定表达的一个克隆感染pLv-EF1α-Luc2-tdT,荧光显微镜下挑选荧光蛋白质稳定表达的单克隆培养扩增;选取其中2个细胞株感染Lv-EF1a-mCherry,流式细胞术分选出mCherry阳性的细胞,再通过慢病毒感染靶向mCherry基因的向导RNA,细胞扩增后,通过荧光显微镜下观察和流式细胞术检测mCherry被敲除的情况;5只BALB/c Nude小鼠皮下接种MIA PaCa-2-Luc2-tdT细胞(1.0×10^(7)个/只),36 d后活体成像。结果筛选到48个Cas9稳定表达的胰腺癌细胞株(其中表达Cas9m1.1的细胞23株,表达Cas9m1.1-Luc2-tdT的细胞25株),筛选到33个荧光蛋白质稳定表达的胰腺癌细胞株(表达EGFP的细胞8株,表达mCherry的7株,表达Luc2-tdT和tdTomato的各9株)。表达mCherry和Cas9的细胞感染mCherry gRNA后,mCherry被敲除。活体成像显示,表达Luc2-tdT的MIA PaCa-2细胞生物发光和荧光发光均存在。结论成功建立了33个荧光蛋白质稳定表达的人和小鼠胰腺癌细胞株,其中表达Luc2-tdT的细胞株具有荧光素酶活性;成功建立了48个Cas9稳定表达的人和小鼠胰腺癌细胞株,Cas9具有基因编辑活性,基因编辑活性因原始细胞系不同而存在差异。

基于化学激活荧光素酶表达基因法和标准方法评估动物源性固态食品中17种二噁英类化合物毒性当量的相关性比较

为使化学激活荧光素酶表达基因法(CALUX)在动物源性固态食品中二噁英类化合物毒性当量筛查中具有更好的适用性,使其能够与标准方法高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC-HRGC)的评估结果相互转换,分别基于CALUX和HRGC-HRGC评估了肉类、海鲜类和配方乳粉这3类典型动物源性固态食品中7种2,3,7,8-取代的多氯代二苯并二噁英(PCDDs)和10种2,3,7,8-取代的多氯代二苯并呋喃(PCDFs)的毒性当量,分析两种方法测定结果的相关性,并确定换算关系和适宜样品类型。结果表明:基于HRGC-HRMS得到的样品中17种目标物的毒性当量(TEQ)下限值为0.001~0.106 pg·g^(-1),TEQ上限值为0.004~0.242 pg·g^(-1),远低于欧盟法规EC 1881/2006规定的限量值(3.5 pg·g^(-1));基于CALUX得到的肉类样品中17种目标物的毒性当量(BEQ)值为0.74~1.30 pg·g^(-1),海鲜类样品中17种目标物的BEQ值为0.31~0.63 pg·g^(-1),配方乳粉样品中17种目标物的BEQ值为0.043~0.074 pg·g^(-1);肉类和配方乳粉样品的BEQ值与TEQ值的相关性较差,而海鲜类样品的BEQ值与TEQ上限值相关性较好。

牦牛KSR2基因的双荧光素酶质粒构建及其与bta-miR-22-3p的靶向验证

为了鉴定牦牛体内bta-miR-22-3p与KSR2之间的靶向关系,本研究采用miRNA Base数据库对牦牛体内bta-miR-22-3p的序列进行分析,并用Target scan软件预测牦牛bta-miR-22-3p于KSR2基因的3’UT R可能存在的结合位点,然后采用PCR扩增出包含bta-miR-22-3p结合位点的牦牛KSR2基因3'非编码区(3’UTR)片段,并构建出KSR2基因的3’UTR的野生型双荧光素酶报告基因质粒和突变型双荧光素酶报告基因质粒,并将其与bta-miR-22-3p mimics、mimics NC共转染至人胚肾细胞(HEK 293T细胞)中,检测其双荧光素酶活性。miRNA Base数据库中bta-miR-22-3p的序列为AAGCUGCCAGUUGAAGAACU G;Target scan预测出bta-miR-22-3p共有包括KSR2基因在内的568个潜在靶基因,其中包括612个保守位点和190个低保守位点,并且在KSR2基因3’UTR的829-836 bp处存在潜在的bta-miR-22-3p的结合位点;构建的野生型质粒和突变型质粒经双酶切后释放出大小315 bp的条带,测序结果与预期一致,说明质粒构建成功;bta-miR-22-3p mimics能够显著降低(P<0.01)KSR2野生型质粒双荧光素酶的活性。最终说明,牦牛KSR2基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并且该基因与bta-miR-22-3p存在靶向关系。

CXCR4-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建及与microRNA-494的靶向作用

目的 构建野生型与突变型CXCR4基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证microRNA-494 (miR-494)对CXCR4的靶向调控作用。方法 使用生物信息学相关软件预测miR-494与CXCR4之间的靶向关系;利用PCR法扩增CXCR4的目的基因片段构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体;将miR-494模拟物和阴性对照物分别与野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR或突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体共同转染NRK-49F细胞,然后进一步检测相对荧光值。结果 成功构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体,荧光结果显示加入miR-494模拟物可使野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR的荧光素酶活性降低约52%,但突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR的荧光素酶活性与对照组相比无显著变化。结论 初步证实miR-494与CXCR4之间存在靶向调控关系。

基于荧光素酶生物发光检测方法的研究及其应用进展

生物发光现象广泛存在于自然界中,不管是在陆地或是海洋都有发光生物的踪迹。其中基于荧光素酶的生物发光系统被广泛研究,启发着人类在基因、表观遗传等方面进行探索,并且开发出一系列相关的检测方法,用于体内体外各方面研究。本文从生物发光系统、荧光素酶的种类以及荧光素酶生物发光检测方法的开发与应用这几个方面进行总结,简要概括近年来基于荧光素酶生物发光检测的研究进展。

一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性质粒的构建及应用

[背景]布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,对畜牧业发展和人类健康有着巨大的威胁。利用新型报告基因NanoLuc荧光素酶构建一种可以检测布鲁菌基因启动子活性的质粒,对于研究布鲁菌毒力基因的调控表达具有重要意义。[目的]制备NanoLuc荧光素酶多克隆抗体,构建一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并通过测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性验证该方法的可行性。[方法]构建NanoLuc荧光素酶原核表达载体pET-Nluc,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;以广宿主质粒pBBR1MCS为骨架,构建质粒pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc,通过电转化构建S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株,在体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性;比较分析virB启动子在胞内感染条件下和体外培养条件下的活性。[结果]通过原核表达获得NanoLuc荧光素酶重组蛋白,并制备得到效价高于1:100 000的多克隆抗体;成功构建pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc质粒以及S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株;体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性,结果显示pNluc质粒可以精确报告其活性;测定virB启动子在胞内诱导条件下和体外培养条件下的活性,结果显示virB启动子活性在胞内感染条件下明显增强。[结论]构建了基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并验证其可以精确反映布鲁菌基因启动子活性,为研究布鲁菌毒力基因以及揭示其致病机制奠定了基础。

大豆拟茎点种腐病菌Phomopsis longicolla荧光素酶标记菌株的制备及应用

大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis/Diaporthe longicolla)可侵染大豆引起种腐病和茎枯病等多种病害。本研究根据该病菌基因组的密码子偏好性,优化了外源的荧光素酶基因序列,通过酵母同源重组构建了荧光素酶表达载体,利用PEG介导的原生质体转化法获得了稳定表达荧光素酶的大豆拟茎点种腐病菌菌株PlYC2-1-Luc。结果显示:荧光素酶基因的引入不影响大豆拟茎点种腐病菌的生长速率和致病力。以PlYC2-1-Luc菌株进行示踪可直观发现:健康大豆中分离的3株内生镰孢菌能够显著抑制PlYC2-1-Luc生长,具有生防潜力;含苯醚甲环唑、精甲霜灵·咯菌腈和咯菌腈·噻霉酮的种衣剂均可抑制PlYC2-1-Luc向大豆种子扩展,表明这些药剂或其成分可用于病害防控;PlYC2-1-Luc对大豆品种Williams的致病力强于齐黄34,表明齐黄34更加抗病。该荧光素酶标记方法具有较好的有效性和稳定性,该研究为进一步开展大豆拟茎点种腐病菌的致病机理及病害防控技术研究提供了一种可视化、高效的菌株材料。

CART基因启动子双荧光素酶重组载体构建

可卡因—苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine regulated transcript peptides,CART)是一种内源性神经肽,广泛分布于中枢神经和外周神经系统。CART具有多种不同的生理功能,在牛繁殖机能研究中发现,CART还可以通过影响雌激素分泌抑制卵泡发育。这一发现为深入分析牛卵泡闭锁以及提高母畜繁殖率提供理论依据。然而%CART%基因转录调控机制尚不明确。研究利用pGL3系列萤火虫荧光素酶表达载体,%Mlu%I、%Xho%I双酶切割牛%CART%基因启动子-475 bp~+22 bp区域,成功构建重组质粒,转染293T细胞,检测相对荧光活性,为后续筛选%CART%基因核心启动子活性片段创造条件,进而为%CART%转录调控分子机制的探究奠定基础。

一种检测蛋白酶活性的荧光素酶报告基因系统的构建及应用

为建立一种检测蛋白酶活性的方法,本研究将IL-1β前体基因和荧光素酶基因融合,克隆至p CAGGS真核载体,构建了基于荧光素酶的报告基因系统(iGLuc),同时构建GLuc真核表达质粒作为对照。以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶为检测对象,利用该报告基因系统对病毒蛋白酶活性进行检测,将iGLuc中蛋白酶酶切位点(FVCDAN)相对应的基因序列替换为Kpn I酶切位点,构建重组质粒Kpn I-iGLuc,然后分别将PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶切割位点对应的核酸序列插入至报告基因Kpn I-iGLuc中的Kpn I位点,构建重组质粒nsp4-iGLuc和S273R-i GLuc。分别将报告基因质粒(iGLuc、GLuc、Kpn I-i GLuc、nsp4-i GLuc和S273R-iGLuc)与不同剂量的相应蛋白酶真核表达质粒共转染HEK293T细胞,24 h后检测上清中荧光素酶GLuc的活性。结果显示,转染i GLuc、nsp4-iGLuc或S273R-iGLuc质粒的上清中荧光信号随着相应蛋白酶的剂量增加而升高,呈现剂量依赖性,而缺失蛋白酶切位点的对照质粒无该现象,表明构建的荧光素酶报告基因能够特异性地检测细胞蛋白酶和病毒蛋白酶的活性。本研究首次建立了一种检测蛋白酶活性的方法,并以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶验证了该方法的应用价值,为后续开展高通量化筛选抗PRRSV、ASFV等药物的研究奠定了基础。

小鼠CCL1基因双荧光素酶报告质粒构建及其与miR-21a-5p靶向关系验证

为了验证miR-21a-5p与CCL1基因的靶向关系,试验利用生物信息学软件预测miR-21a-5p和CCL1基因的结合位点,设计引物合成CCL1基因3′非翻译区(UTR)野生型及突变型目的片段,并将其克隆到psiCHECK2质粒上构建CCL1野生型(CCL1-WT)和突变型(CCL1-MUT)双荧光素酶报告质粒。将构建好的CCL1-WT和CCL1-MUT分别与miR-21a-5p模拟物(miR-21a-5p mimic)和阴性对照(miR-NC)共同转染到293T细胞中,检测CCL1-WT+miR-NC组、CCL1-WT+miR-21a-5p mimic组、CCL1-MUT+miR-NC组、CCL1-MUT+miR-21a-5p mimic组的荧光素酶活性。结果表明:CCL1基因是miR-21a-5p的潜在靶基因;CCL1野生型和突变型双荧光素酶报告质粒测序结果与预期结果一致;与CCL1-WT+miR-NC组相比,CCL1-WT+miR-21a-5p mimic组荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而CCL1-MUT+miR-NC组与CCL1-MUT+miR-21a-5p mimic组之间差异不显著(P>0.05)。说明CCL1基因野生型及突变型双荧光素酶报告质粒构建成功,且miR-21a-5p与CCL1基因存在靶向关系。

牦牛VEGFA双荧光素酶载体构建及与miR-200b的靶向验证

为探究微小RNA(miR-200b)与血管内皮生长因子A(VEGFA)基因之间的靶向关系,采用miRanda和Targetscan软件预测牦牛miR-200b与VEGFA可能存在结合位点,构建了VEGFA基因3′UTR区的野生型和突变型双荧光素酶载体。利用与目的miRNA靶种子序列相结合基因的突变序列,构建该靶基因的突变型重组质粒(pGL3-promoter-mut VEGFA),再进行重组质粒和目的miRNA的miRNA mimic的共转染实验。结果表明,预测到的miR-200b与VEGFA基因的3′UTR区存在结合位点。PCR进行扩增和测序之后,VEGFA基因3′UTR区的野生型、突变型载体构建成功。共转染VEGFA野生型载体和miR-200b mimic的双荧光素酶活性极显著低于对照组(P<0.05),VEGFA突变型载体和miR-200b mimic共转染的双荧光素酶活性与对照组无显著差异(P>0.05)。说明VEGFA基因的3′UTR区能与miR-200b结合并抑制双荧光素酶活性,验证了VEGFA是miR-200b的靶基因。

灯盏乙素通过环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子通路抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症

目的探讨灯盏乙素对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症的影响。方法培养BV-2小胶质细胞系,将BV-2小胶质细胞分为对照组(Ctrl)、环状GMP-AMP合酶(cGAS)抑制剂RU320521(RU.521)组、LPS组、LPS+RU.521组、LPS+灯盏乙素预处理(LPS+S)组、LPS+S+RU.521组,共6组。Western blotting及免疫荧光双标染色法检测并观察BV-2小胶质细胞中cGAS、干扰素基因刺激因子(STING)、核因子κB(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、PYD结构域蛋白3(NLRP3)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达变化(n=3)。结果Western blotting和免疫荧光双标染色均显示,与对照组相比,LPS诱导后,BV-2小胶质细胞中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+S组中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)。使用cGAS通路抑制剂RU.521后显示了与灯盏乙素预处理组相似的作用效果。此外,NF-κB在各组的变化不明显(P>0.05)。结论灯盏乙素干预抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症反应,可能与cGAS-STING信号通路有关。

基于Golden Gate高效构建psiCHECK双荧光素酶报告基因的方法及应用

目的 基于Golden Gate技术构建psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,并探讨其能否用于RNA干扰(RNA interference, RNAi)药物筛选。方法 通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增CcdB致死基因、氯霉素基因与Golden Gate组装所需的BsmBI酶切位点,将其克隆至psiCHECK-2载体,构建出重组载体psiCHECK-CcdB。利用2种大肠杆菌DB3.1与DH5α对该载体的致死效率进行检测,选用1 387 bp大小的外源片段克隆至psiCHECK-CcdB载体,检测其连接效率,并验证重组载体能否发挥双荧光素酶报告系统功能,监测目的基因的表达变化。结果 菌落PCR以及测序鉴定psiCHECK-CcdB重组质粒构建成功,该质粒可有效致死无法耐受CcdB毒素的大肠杆菌DH5α菌株,在DB3.1菌株中正常生长。采用Golden Gate的方法可将外源片段简单快速克隆至psiCHECKCcdB载体中,连接效率显著提高且低背景克隆。通过测定双荧光素酶表达强度,证实了小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向性结合目的基因可显著下调荧光素酶的表达,成功发挥双荧光素酶报告基因功能。结论 本研究成功构建了psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,应用Golden Gate组装技术,简化了实验操作流程,降低了实验成本,具备较高的阳性克隆率与多片段一次性组装的潜力,在RNAi药物筛选领域应用前景广阔。

荧光素酶生物发光法在快速药敏试验中的研究与应用

目的通过荧光素酶生物发光法与微量肉汤稀释法对质控菌株和临床收集菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)进行测定,探讨荧光素酶生物发光法在病原微生物快速药物敏感性试验中的应用价值。方法以D-荧光素钠、Mg^(2+)、O_(2)和待测菌株为荧光素酶催化反应底物,连续检测待测菌与抗生素孵育过程中相对光强度(relative light unit,RLU)变化,计算发光率并确定MIC,分析与微量肉汤稀释法的基本一致性(essential agreement,EA)和分类一致性(categorical agreement,CA)。结果荧光素酶生物发光法快速检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等质控菌株MIC与微量肉汤稀释法检测MIC结果CA和EA值均为100%;并应用该检测体系对91株临床革兰阴性菌样本、93株革兰阳性菌样本进行MIC测定,革兰阴性菌检测结果中的6种药物EA和CA分别大于90%和84%,革兰阳性菌检测结果中的6种药物EA和CA分别大于90%和80%,并使检测周期由常规药敏实验的16~24 h缩短至5~6 h。结论荧光素酶生物发光法快速检测药敏结果与微量肉汤稀释法结果具有较高一致性,且更快速、敏感,可为今后的临床检验工作提供全新的快速药敏检测方法。

荧光素酶辅助定量大肠杆菌破碎效果的方法

建立基于萤火虫荧光素酶的大肠杆菌超声破碎辅助定量方法,利用荧光素酶灵敏度高、检测迅速的特点,对靶细胞的破碎效果进行表征。以表达了萤火虫荧光素酶的大肠杆菌作为内标,在破碎前与靶蛋白表达菌按一定比例混合,考察不同破碎条件下荧光素酶和靶蛋白活性向胞外释放的情况,对辅助定量效果进行评价。结果表明,将表达了萤火虫荧光素酶的大肠杆菌按1∶500(体积比)同待破碎菌悬液混合,能够通过破碎后上清液中荧光素酶活性的变化,正确反映靶细胞的破碎程度,并为破碎过程中蛋白质的活性保存提供参考。破碎产物中引入的荧光素酶,对后续靶蛋白的镍珠法纯化没有影响。含有萤火虫荧光素酶的菌体,可在-80℃环境下保存至少90 d而不产生酶活性的显著下降,且细胞对超声破碎的耐受性也不因冻存改变,可在临用前直接解冻并与靶细胞混合,起到辅助定量作用。因此,利用萤火虫荧光素酶对大肠杆菌超声破碎的程度进行辅助定量,是简便、稳定且高效的。

绿色荧光蛋白-荧光素酶标记的人源化非小细胞肺癌原位动物模型建立方法

目的采用绿色荧光蛋白-荧光素酶(GL)标记的人类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞建立人源化NSCLC原位动物模型。方法制备GL逆转录病毒液。将上述病毒液转染至处于对数生长期的人类NSCLC细胞株(H460细胞)后进行流式分选,从而构建稳定的GL阳性H460细胞(H460-GL细胞)。将15只Nod-Scid小鼠随机分为低剂量组(n=5)、中剂量组(n=5)、高剂量组(n=5),分别以H460-GL细胞1.0×10^(4)个/20μL、1.0×10^(6)个/20μL、1.0×10^(8)个/20μL的密度进行小鼠肺组织原位注射。实验期间观察各组小鼠的一般情况及存活情况。每周通过荧光活体成像观察各组小鼠体内肿瘤的成活、生长情况。造模后第35天处死成瘤小鼠,取肺组织进行病理组织学观察。结果(1)大部分小鼠出现呼吸系统肿瘤相关症状;濒死期小鼠胸腔内均出现不规则形状的白色肿瘤组织,且其与周围肺组织及心脏粘连严重。(2)造模后第22天开始各组小鼠逐渐死亡,于造模后第35天低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠的存活率分别为80%(4/5)、20%(1/5)、0。(3)在低剂量组中,于造模后第14天仅有1只小鼠出现H460-GL细胞荧光,造模第28天的成瘤率为60%(3/5),且成瘤小鼠体内的荧光强度大小不一;在中剂量组、高剂量组中,所有小鼠在造模后第7天均出现H460-GL细胞荧光,且荧光均逐渐增强,在造模后第14天、第21天成瘤小鼠体内的荧光强度相似且较为均匀。结论该造模方法可获得稳定的人源化NSCLC原位动物模型,且操作简便、易于复制,可在动物体内模拟人类NSCLC发生、发展、转移过程,并能实时观察肿瘤大小与转移路径。

荧光素酶研究进展

荧光素酶 (Luciferase)可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。萤火虫荧光素酶是分子量为 60～ 64kD的多肽链 ,在Mg2 +、ATP、O2 存在时 ,催化D 荧光素 (D Luciferin)氧化脱羧 ,发出光 (λ =5 5 0～ 5 80nm)。细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的加单氧酶 ,它催化长链脂肪醛、FMNH2 和O2 的氧化反应 ,发出绿蓝光 (λ =490nm)。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶可分别从萤火虫和发光细菌中直接提前 ,亦可用基因工程的方法进行生产。荧光素酶催化的发光反应能用生物发光检测仪进行灵敏、快速检测 ,因此该酶有多方面的用途 ,如应用于快速检测、报告基因分析。

虫荧光素酶报告基因用于二噁英类化学物质的检测

虫萤光素酶报告基因检测二英类化学物质与传统的EROD法比较 ,灵敏度及线性范围均优于EROD法 ,并且检测时间缩短 ,操作简便。

荧光素酶报告基因在转基因蚕中的应用

报道了在针对BmNPV的核酶转基因蚕筛选过程中利用荧光素酶报告基因的检测及鉴定结果。试验采用的质粒为含家蚕核多角体病毒(BmNPV)的即刻早期蛋白基因IE启动子荧光素酶(Luciferase)报告基因———抗NPVIE核酶基因的联合重组质粒pIELucRz。该质粒经限制性内切酶ScaⅠ线性化后,用基因枪法导入家蚕早期受精卵(G0),待G1代测定荧光素酶活性表达较高的蚕的羽化交配产卵,分别于G2、G3和G4代再用BmNPV接种筛选出对NPV抗性较高的蚕继代。其中G4代转基因蚕基因组DNA经PCR测定及Southern杂交分析显示,荧光素酶基因已插入家蚕基因组DNA,并以多拷贝形式存在。这表明荧光素酶基因是转基因蚕研究有效的报告基因之一。