贝类水产品星状病毒高效NanoPCR检测方法的建立及初步应用

人星状病毒(Human astrovirus,HAstV)是导致全球腹泻的主要病原体之一,主要存在于贝类水产品中.消费者通过加工、烹饪贝类水产品等过程感染HAstV,并伴有腹泻、呕吐等临床症状.因此,为及时发现贝类水产品中的HAstV和保障消费者食品安全,本研究将纳米材料融入到PCR检测方法中,建立一种操作简便、灵敏度高和特异性强的HAstV检测方法.针对具有保守HAstVORF2基因序列设计特异性引物,通过优化纳米金颗粒含量、引物浓度及退火温度,建立HAstV纳米PCR(Nanomaterial-assisted PCR,NanoPCR)检测方法.研究发现HAstVNanoPCR检测方法具有较高的敏感性和特异性,其最低病毒检测限为2.0×10^(0)copies/μL,灵敏度是传统PCR的1000倍,与贝类水产品中其他常见的病毒无交叉反应;HAstV NanoPCR方法检测贝类水产品HAstV检出率为7.5%,而传统PCR检出率为5.35%.研究表明建立的HAstV NanoPCR检测方法适用于筛选贝类水产品中的HAstV,后续可应用于检测水产品中HAstV流行情况,为保障消费者食品安全提供技术保障.

非洲猪瘟病毒NanoPCR检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、适用于大批量样品检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的方法,本研究使用金纳米颗粒与传统PCR技术相结合,针对ASFV中P72保守序列,建立了一种新的ASFV的NanoPCR分子检测方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果表明,对于相关病毒,包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV),NanoPCR分析均未发现交叉反应。与常规PCR相比,NanoPCR灵敏度更高,每个反应的检出限为2.86×10~3copies/μL,而常规PCR检出限为2.86×10~4copies/μL。用建立的方法对23份临床样品进行检测,结果 ASFV的阳性检出率为60.86%。综上所述,本研究开发的灵敏、特异性的NanoPCR方法可广泛应用于ASFV感染的临床诊断和现场监测。

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。

猪细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立

为建立快速、灵敏的猪细小病毒(PPV)的检测方法,本研究针对PPV VP2基因的保守区域设计一对扩增472 bp片段的特异性引物,建立了PPV纳米PCR检测方法。敏感性试验表明纳米PCR方法是普通PCR的1 000倍,最低核酸检出量为4拷贝/μL。利用该纳米PCR方法检测猪的其他相关病毒核酸,结果均呈阴性。分别采用纳米PCR和普通PCR对3个省份送检的43份临床样品进行检测,PPV阳性率分别为95%(41/43)和72%(31/41),表明该纳米PCR检测方法具有更高的敏感性,适用于PPV低含量临床样品的检测。

鉴别猪伪狂犬病病毒强弱毒的高效纳米PCR检测试剂盒及初步应用

试验建立了鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒高效纳米PCR检测方法，并对相关条件进行优化，组装了试剂盒。根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB（431 bp）、gE（316 bp）和gG（202 bp）3个基因，用于区分PRV强毒与基因缺失毒株，优化反应条件后建立了纳米PCR检测PRV强弱毒的方法并组装试剂盒，对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性及保存期评估试验，并对临床样品进行检测。特异性试验表明，此试剂盒对于PRV能够扩增出431（gB）、316（gE）和202 bp（gG）的目的片段，对于PRV-Bartha-K61能够扩增出431和202 bp的目的片段，对于猪捷申病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及大肠杆菌等DNA或cDNA均未扩增出条带。敏感性试验表明，此试剂盒的方法比常规PCR方法敏感100-1000倍，最低核酸拷贝数检出量可以达到101 copy/μL数量级。试剂盒的批内、批间检测结果无明显差异，稳定性良好。-20℃至少可保存12个月。在对中国黑龙江、吉林等7个省市的临床送检的117份样品进行检测，结果显示，PRV强毒阳性率为51%，阴性率为49%，未发现有弱毒感染。鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制，对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义，而且也可以用于其他动物PRV感染的检测和早期诊断。

猪伪狂犬病毒纳米PCR检测方法的建立

[目的 ]快速灵敏检测猪伪狂犬病毒(PRV)[方法 ]根据PRV g B基因设计特异性引物,建立了PRV纳米PCR检测方法。[结果 ]PRV纳米PCR方法的最低检出限为10拷贝/μL,其敏感性比未添加纳米金的对照PCR提高100倍;建立的纳米PCR与猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒等常见猪病毒性病原均无交叉反应。应用纳米PCR和PRV国家标准中的PCR方法,对2014—2016年期间采集自17个省市发病猪场的148份临床样品进行平行检测,PRV纳米PCR的阳性检出率为49.3%(73/148),PRV国标PCR方法的阳性检出率为23.6%(35/148),并且PRV纳米PCR检测为阳性,而PRV国标PCR方法检测为阴性的38份样品,测序结果均确认为PRV阳性。[结论 ]本研究建立的纳米PCR检测方法敏感特异,可用于猪伪狂犬病的病原学检测。

纳米基因扩增技术及其应用

聚合酶链式反应(PCR)是20世纪80年代中期发展起来的一种应用广泛的体外DNA扩增技术,但目前该技术仍然存在着一些问题,如特异性差、灵敏度低和假阳性等。近年来,随着纳米科技的发展,一些纳米粒子如金属纳米粒子、碳纳米材料、量子点和纳米金属氧化物等被引入到PCR反应体系中,即纳米基因扩增技术(Nano PCR)。该技术大幅度提高了PCR的扩增效率、选择性、灵敏度和特异性,推动了生物学技术的发展,具有非常重要的理论意义和应用价值。本文综述了近年来纳米基因扩增技术的主要研究进展、反应机理,并探讨了其应用研究。

新型冠状病毒纳米PCR快速检测方法的建立

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可导致致命性肺炎,且极具传染性。自2019年年末在我国出现以来,已在全球蔓延。为了建立一种灵敏、快速检测SARS-CoV-2的分子检测方法,本研究使用金纳米颗粒配合普通PCR检测方法,针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白建立了SARS-CoV-2 NanoPCR新型分子检测方法。特异性结果显示,该方法对猪流行性腹泻病毒、牛冠状病毒、犬冠状病毒、水貂冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒均无交叉反应,表明该方法的特异性良好。敏感性结果显示,该方法的最低检测量为3.69×10^(4)拷贝/μL,高于普通PCR最低检测量10倍,表明该方法的敏感性良好。使用建立的方法对3份临床样品进行检测,该方法与普通PCR方法结果一致,10倍稀释样品后,NanoPCR相比较普通PCR条带仍然具有较高辨识度。综上,本研究建立的灵敏、特异的NanoPCR方法可以对临床样品进行快速诊断和鉴定。