小鼠Nanog基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

按照nanog基因编码序列设计合成引物,利用RT-PCB从小鼠的囊胚期胚胎中扩增得到该 基因,并将该基因克隆到pET-28b(+)载体上,获得pET-28b(+)-nanog原核表达重组质粒,限制 性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆 菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达,western杂交证实该 蛋白具有6-His抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog蛋白。

中国白兔白介素-15基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的表达

以RT-PCR技术对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞（PMBCr）进行扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-15基因进行序列比较。结果IL-15基因全长489 bp,编码162个氨基酸,其中前29个氨基酸残基构成信号肽序列。与不同物种IL-15基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异。在推导的中国白兔IL-15氨基酸序列中,在108～110、119～121、127～129和143～146位存在4个潜在的N-联糖基化位点,同时存在6个Cys残基。将pTIL-15双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-15,转化大肠杆菌BL21（DE3）,并用IPTG进行了诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为20 500的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。

以淀粉酶基因为筛选标记的E.coli克隆载体的构建

以E．coli质粒pJRD184为基础，将多酶切点引入地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的a－淀粉酶基因信号肽编码区的PstI切点，构建了能表达并将a－淀粉酶（Amy）渗漏到胞外的E．coli克隆载体pLAM9712．该载体可根据在含有可溶性淀粉的LB平板上菌落周围有没有淀粉水解圈直接筛选重组子，从而避免了使用异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D一半乳糖苷（X－gal），代之以廉价的碘、淀粉．实验进一步验证了pLAM9712在基因克隆中的可行性及质粒本身的稳定性．

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。利用该系统表达重组蛋白具有许多优越性,但其表达效率受诸多因素的影响。综述了国内外利用大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白的策略,主要包括选择合适的启动子、改变信号肽结构、提高 mRNA稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解,利用融合蛋白与分子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。

Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶酶原基因的鉴定及在大肠杆菌中的表达

【目的】鉴定来源于吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因;研究其在大肠杆菌系统的克隆与表达;分析该酶与其同源酶的活性中心氨基酸序列。【方法】从本实验室筛选的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus;CCTCC M203062)发酵液中,分离纯化得到谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-MTGase),测得N-端前十个氨基酸序列并与其它链霉菌来源的相应基因序列比较设计引物,扩增得到pro-MTGase基因,将该基因插入到表达载体pET-20b(+)信号肽pelB下游,构建分泌型表达载体pET/pro-MTG,并转化不同的大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS。【结果】获得了pro-MTGase的完整基因序列,多重碱基序列比对表明其与S.platensis和S.caniferus的pro-MTGase基因同源性高达92%。利用Rosetta(DE3)pLysS通过降温至24℃诱导策略,获得部分胞外表达的酶原。SDS-PAGE显示,胞外表达重组蛋白的分子量约为44kDa,与吸水链霉菌表达的天然酶原相符。诱导4h后发酵液中的重组酶原经胰蛋白酶活化为成熟酶后测得最高酶活为0.24U/mL。【结论】该研究是对吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因的首次报道,也是国内首次利用大肠杆菌实现pro-MTGase的胞外可溶性表达。

纳豆激酶基因重组质粒在大肠杆菌与毕赤酵母中的稳定性

利用PCR方法以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因片段 ,分别克隆到原核表达载体 pBV2 2 0与真核表达载体pPICZαA上 ,转化大肠杆菌HB1 0 1与毕赤酵母GS1 1 5 ,筛选重组子 ,通过限制性内切酶、PCR分析及序列测定 ,确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因 ,对重组大肠杆菌与毕赤酵母中外源基因的稳定性进行研究比较 ,结果表明外源基因的插入对宿主菌的生长没有太大影响 ,重组质粒在E .coliHB1 0 1中具有良好的分离稳定性 ,而结构稳定性较差 ,而外源基因在毕赤酵母GS1 1

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b(+)中,构建了表达载体pET-20b(+)/cgt,并将其转化表达宿主E.coliBL21(DE3)。对重组菌E.coliBL21/pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件:葡萄糖8 g/L,乳糖0.5 g/L,蛋白胨12 g/L,酵母膏24 g/L,K2HPO472 mmol/L,KH2PO417 mmol/L,CaC l22.5 mmol/L;初始pH为7.0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90 h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22.1 U/mL,与来源菌P.macerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3 L发酵罐中发酵,90 h后胞外酶比活达到22.6 U/mL,证实了工业化放大的可能性。

猪生长激素cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素 (GH)成熟肽基因序列 ,定向克隆至质粒pUC18。序列分析表明 ,克隆的猪GHcDNA长 5 73bp ,不含信号肽序列 ,并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV2 2 0 ,构建成重组猪GH基因表达载体pBVpGH7。SDS PAGE和薄层扫描分析表明 :经 42℃诱导 ,pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约 2 2 0 0 0的特异蛋白 ,表达量约占细胞总蛋白的 2 0 .5 %。

尿酸酶产生菌的筛选、基因克隆及表达

目的:构建表达尿酸酶的重组基因工程菌,提高尿酸酶的表达量。方法:从12株酵母菌中筛选得到1株产尿酸酶的产朊假丝酵母Cu2357菌株,应用DNA重组技术,将野生菌尿酸酶基因克隆到表达载体pKA中,获得重组尿酸酶基因工程菌E.colipKU/JM109。结果:构建的表达载体中的目的基因序列正确。经SDS-PAGE检测表明,表达的蛋白质相对分子质量约为34 kDa,含量占细胞可溶性蛋白的49%。优化培养条件后,发酵液尿酸酶活力可达16 U/mL,是野生菌产尿酸酶量的240多倍。结论:尿酸酶基因在E.colipKU/JM109中实现了高效表达。

致病性鳗弧菌W-1外膜蛋白ompU基因克隆及在大肠杆菌中的表达

从致病性鳗弧菌W-1基因组DNA扩增并克隆了1 156bp的特异性片段,含有完整的外膜蛋白ompU基因阅读框,由993个核苷酸组成,编码330个氨基酸残基的蛋白质。与国外已发表的鳗弧菌外膜蛋白基因的序列同源性为100%,与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的序列同源性分别为72%,69%,68%和64%。将该外膜蛋白基因克隆于pBV220表达质粒,在大肠杆菌中得到了表达,SDS-PAGE分析表明表达蛋白分子量约38kDa,Western blot分析发现表达蛋白能与鳗弧菌外膜蛋白抗体很好的反应。

大肠杆菌不耐热性肠毒素LT_B基因的克隆及其核苷酸序列分析

用内切酶ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切大肠杆菌质粒ｐＥＷＤ２９９，回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段，再将载体ｐＵＣ１８用ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，最后将ｐＵＣ１８ＤＮＡ与５０５ｂｐ的ＬＴＢＤＮＡ进行连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＳａｃⅠ／ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１。再将ｐＸＬＴ１进行ＥｃｏＲⅠ酶切、大肠杆菌聚合酶ⅠＫｌｅｎｏｗ大片段补平、ＨｉｎｄⅢ酶切处理，然后与用ＨｉｃⅡ和ＨｉｎｄⅢ酶切的ｐＵＣ１８连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＸｂａⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１－１。将质粒ｐＸＬＴ１－１进行核苷酸序列分析。

大豆查尔酮合成酶(CHS)基因的克隆、表达及其在雪莲提取液中的代谢产物分析

以栽培大豆北丰12为材料,利用PCR方法克隆查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)全基因,采用SOE法克隆得到去掉内含子的查尔酮合成酶基因,核酸序列分析表明,该基因编码区长1170bp,编码390个氨基酸,与已报道的GMCHS8(GenBank:AY237728)的cDNA序列相似率达到97%。构建pET-GMCHS工程表达质粒,通过大肠杆菌E.coliBL21(DE3)高效表达系统表达大豆CHS。通过12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在42.9kDa的一条蛋白质特异表达带。液相色谱分析大肠杆菌E.coliBL21(DE3)高效表达系统在雪莲提取液中的代谢产物,样品和空白对照样对比,样品在273nm,3.0min出现新的吸收峰,质谱分析结果表明CHS利用雪莲提取液中代谢中间产物合成了新的黄酮类物质。

枯草杆菌启动子－信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗性基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体，克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢｏｍＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接，转化大肠杆菌Ｃ６００，筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子，从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析，显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧链终止法测定了１０个克隆片段的ＤＮＡ顺序，结果表明，克隆的片段都含有启动子、核糖体结合优点及信号肽序列。克隆片段可以在大肠杆菌和枯草杆菌中恢复氨苄青霉素抗性的表型。β－内酰胺酶活力测定结果证明：大肠杆菌的酶活力主要积累在周质空间内而枯草杆菌的酶活力主要分泌到胞外。

致肾盂肾炎大肠杆菌粘附基因群的克隆及其抗血清的制备

以柯斯质粒pHC79为载体构建致肾盂肾炎大肠杆菌代表株E.coli J96染色体基因文库,获得两个能够表达粘附特性的重组柯斯质粒.进一步用鸟枪法亚克隆到载体pACYC184,得到三个阳性重组体.其中pCT10/E.coli K-12 p678-54能够稳定表达P菌毛和MRHA,分子量为14.6kb.用该克隆子免疫新西兰白兔,抗血清用带有载体质粒的受体菌(pACYC184/E.coli K-12 P678-54)吸收后,经菌毛粗提物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blotting和血凝抑制试验检测,其特异性仅针对致肾盂肾炎大肠杆菌的粘附基因群,可用于临床菌株的鉴定.

植物内生蜡样芽孢杆菌M22 Mn-SOD基因的克隆及在大肠杆菌中表达

通过PCR和反向PCR,从蜡样芽孢杆菌M22中扩增到2条长度为1 322 bp和1 395 bp的基因片段(GenBank登录号为AY540749和AY468485),分别含657 bp和627 bp的开放阅读框,各自编码218个和208个氨基酸残基的功能蛋白。2个蛋白氨基酸序列同源性为46％,均不含信号肽。与其它锰超氧化物歧化酶序列同源性高,保守氨基酸残基类型及位置与其它Mn-SOD相同,可确定2个基因均为蜡样芽孢杆菌Mn-SOD基因。分别将2个基因的开放阅读框插入载体pET-22b(+)构建表达质粒pET-sodA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量分别为28 kD和27 kD。转入pET-sodA的SOD缺陷型大肠杆菌QC779转化子恢复在10μmol/L paraquat的LB平板上生长的能力。活性电泳显示,M22的Mn-SOD在QC779中成功表达。

细菌耐热植酸酶基因的克隆及表达

设计筛选培养基 ,从 2 0 3株细菌菌株中筛选到四株可以分解植酸的菌株 :SD0 1N ,SD0 1X ,SD0 1B和SD0 1D ,设计植酸酶基因特异性引物P1和P2 ,分别以这四株菌的基因组DNA为模板进行扩增 ,其中菌株SD0 1N出现一条明显的扩增条带 ,大小约 1 2kb。对PCR产物进行序列分析表明 ,该片段含有一个编码 383个氨基酸的开放阅读框架。将该片段与载体pQE 30连接后转化大肠杆菌M1 5 ,得到重组菌株SDLiuTP0 1 ,对该菌株进行培养 ,经IPTG诱导基因表达 ,与携带空载体菌株相比较 ,在菌株SDLiuTP0 1中可检测到植酸酶活力。对重组菌株的植酸酶活力考察表明 ,该酶在 2 5℃～ 95℃温度范围均具生物活性 ,最适反应温度为 75℃ ,属于耐热性植酸酶。在各pH缓冲系统中反应结果 ,酶活力出现两个较高值 ,分别为pH4 6和pH7 5。

大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的克隆与表达优化

为了在大肠杆菌中表达大肠杆菌丙酮酸脱氢酶,用PCR法从大肠杆菌总DNA中克隆了pdc基因,将其插入载体pGEX-KG后转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下实现了表达。通过对表达条件的优化,在TB+M9(1∶1)培养基中,33℃下使用终浓度0.5 g.L-1的乳糖诱导4 h,重组大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的表达量可占全菌蛋白的45%左右,比未优化前提高了约20%,同时大大降低了成本。

基因工程构建表达融合蛋白GST-FCoAT的益生大肠杆菌EcN-Frc

目的:将产甲酸草酸杆菌代谢草酸基因Frc克隆至表达载体PGEX-4T-2,转化大肠杆菌EcN,稳定表达甲酰辅酶A转移酶。方法:采用PCR方法从产甲酸草酸杆菌基因组中获得Frc基因,插入到载体PGEX-4T-2,转化EcN,IPTG诱导表达GST-FCoAT融合蛋白,产物行western-blot鉴定分析。结果:EcN-Frc可稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT。结论:改造后的EcN能诱导表达甲酰辅酶A转移酶,将为下一步体内外代谢草酸实验和临床治疗高草酸尿和防治草酸结石的益生菌制剂的研究奠定基础。