河八王转录组SSR和SNP序列特征及系统发育分析

【目的】对甘蔗野生种河八王转录组SSR和SNP序列特征及系统发育进行分析,为深入研究甘蔗属植物分子标记开发、种质资源利用、种群遗传结构和分化历史动态提供参考。【方法】基于河八王转录组数据,利用MISA和SOAPsnp软件对获得的Unigenes进行SSR和SNP位点发掘及序列特征分析,并从JGI数据库下载二穗短柄草、水稻、谷子、高粱、玉米物和拟南芥转录组数据,采用最大似然(ML)方法构建系统发育进化树,并估算物种分歧时间。【结果】通过河八王转录组测序共获得171000000条Raw reads,经过数据过滤获得156800000条Clean reads,经进一步组装后获得130393条Unigenes,其中有14233条Unigenes含有16372个SSR位点,发生频率为12.56%。含有1个以上SSR位点的Unigenes有1839条,复合型SSR位点有656个。SSR重复基元类型丰富,从单核苷酸到六核苷酸重复均有分布,共有612种SSR重复基元种类,数量最多的类型为三核苷酸重复类型(49.16%),其次是二核苷酸重复(25.54%)和单核苷酸重复(18.30%)。在所有的核苷酸重复类型中,重复基元占SSR位点总数比例<0.50%的类型有14种,出现频率较高的3种重复基元分别为CCG/CGG、A/T和AG/CT。SSR序列长度为12~191 bp,其中长度≤25 bp的SSR位点共有15123个,占SSR位点总数的96.23%,其中长度为15 bp的数量最多,占SSR位点总数的32.16%。SSR重复基元的重复次数为4~24次,且以5、6和7次重复为主。河八王转录组序列共有222106个SNP位点,平均每条Unigenes上有1.70个SNP位点,核苷酸转换类型的比例(65.92%)明显高于颠换类型(34.08%),6种单核苷酸变异类型中,A/G发生频率最高(33.07%),其次是C/T(32.84%)。系统发育分析和物种分化时间估算结果显示,河八王与高粱的亲缘关系最近,分化时间为14.6百万年(Ma)。【结论】河八王转录组中SSR和SNP位点非常丰富,具有较高的遗传多态性,说明利用转录组测序开发甘蔗SSR和SNP分子标记是一种切实可行的方法。利用转录组数据构建系统发育进行树的方法可用于其他缺乏基因组数据的物种系统发育研究。

甘蔗与河八王属间杂种的SSR标记鉴定

以甘蔗属优良甘蔗新品种(系)为母本,以收集于广西的河八王属材料为父本进行有性杂交,利用SSR标记对获得的杂种进行真实性鉴定。从70对甘蔗SSR引物中筛选出9对用于对5个甘蔗×河八王组合的57个杂交后代植株进行鉴定,结果表明,其中有14株具有双亲特征带,确定为真杂种。SSR标记可用于甘蔗河八王杂种真实性鉴定,研究结果为甘蔗野生种质河八王属植物的杂交利用及相关基础研究奠定了良好的基础。

基于AFLP标记的河八王种质资源遗传多样性分析及分子身份证构建

以广西地区的15份河八王无性系为材料,采用AFLP标记结合毛细管电泳进行分析,计算多态性引物的总扩增条带数、多态性条带数和多态性条带比率。进行遗传相似系数和UPGMA聚类分析,并建立分子身份证。25对AFLP引物组合在15份河八王种质资源中共扩增出2 208个位点,其中多态性位点1 914个,多态性比率(PPB)为87.11%。UPGMA聚类分析表明,供试的15份河八王种质资源其遗传相似系数变化范围在0.656~0.878,在相似系数为0.706时,可划分为3个类群。结合特征带和不同引物组合方法可有效建立河八王种质资源特异分子身份证,置信概率达到99.99%。所供试河八王种质具有较丰富的遗传多样性水平,基于3对AFLP引物组合104条谱带构建的15份河八王种质分子身份证具有唯一性,AFLP标记是在分子水平上鉴定河八王种质的有效方法。

甘蔗与河八王杂交双亲染色体在F_1、BC_1和BC_2代的传递研究

对甘蔗与河八王属间杂种F_1、BC_1和BC_2及其亲本材料的根尖体细胞染色体数目进行观察及传递分析,以探讨甘蔗与河八王染色体在不同世代的传递方式。采用根尖分生区细胞酶解去壁低渗法制片,每个世代选择5个子代进行染色体计数及传递分析。结果表明,广西河八王1号(GXN1)的染色体为30条,其他亲本和子代数目存在2~5条变幅。甘蔗与河八王染色体在F_1代以n+2n方式进行传递,部分材料的染色体略有增加;在BC_1和BC_2代中均以n+n方式进行传递。研究结果为河八王在甘蔗育种中的进一步利用提供了细胞学参考。

甘蔗与河八王杂交F_1对黑穗病的抗性鉴定与初步评价

【目的】探明甘蔗与河八王杂交F_1品系对黑穗病的抗性水平,为筛选河八王亲本进行抗黑穗病育种提供理论依据。【方法】以广西蔗区甘蔗黑穗病混合孢子粉为接种源,采用人工浸渍接种与自然感病相结合的发法,对甘蔗与河八王杂交F_1与对照品种(系)共18个材料进行黑穗病抗性鉴定。通过潜伏期、接种发病率、自然发病率,结合标准对照种的抗性表现,评价参试品系的抗性,并采用系统聚类分析验证。【结果】抗性水平为高抗(HR)的品系有SNF_110-6-11、SNF_110-6-22、SNF_110-6-23,占16.67%;抗(R)品系有SNF_110-6-13、SNF_110-6-14、SNF_110-6-17、SNF_110-6-20,占22.22%;中抗(MR)品系有F_134、SNF_110-6-12、SNF_110-6-15,占16.67%;中感(MS)品系有NCo310、NCo376、SNF_110-6-21,占16.67%;感(S)品系有Ya71-374、ROC22、SNF_110-6-18,占16.7%。【结论】甘蔗与河八王杂交F_1品系对黑穗病的抗性较高,可作为甘蔗抗黑穗病育种亲本材料。

^(15)N自然丰度法分析甘蔗及近缘属野生种固氮效率

利用^(15)N同位素自然丰度法,在连续两年不施氮肥条件下,对甘蔗及近缘属野生种(材料)的固氮效率进行对比分析,同时筛选出适宜本试验研究的参比植物。试验结果表明,河八王及其后代材料表现出明显的高固氮能力,最高固氮率达到36.13%,最低的为甘蔗栽培种ROC22,固氮率仅为5.72%。银胶菊、胜红蓟和狗尾草与河八王1-1号的δ^(15)N值之差为3.13~3.50,是分析甘蔗及近缘属野生种固氮效率较理想的参比植物。

河八王分蘖基因NpD53克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆河八王[Narenga porphyrocoma(Hance)Bor]分蘖基因NpD53,并分析其序列特征,为甘蔗野生种分蘖的分子机理研究提供理论参考。【方法】以河八王为试验材料,提取其叶片总RNA,反转录获得cDNA,通过RACE(cDNA末端快增)技术扩增NpD53基因,并采用生物信息学方法对其核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行分析。【结果】NpD53基因(Gen Bank登录号MF593461)的中间序列长度760 bp、5'端序列长度1497 bp、3'端序列长度1233 bp,拼接后其cDNA序列全长为2597 bp,包含1个2037 bp的开放阅读框(ORF),编码678个氨基酸,蛋白分子量75.02 k D,等电点6.59,亲水性平均数-0.506,表明其为亲水性蛋白,位于细胞核内(可信度94.1%)。NpD53基因编码蛋白(NpD53)存在P-loop_NTPase和Clp B_D2-small超家族核心序列,含有4个非特异性位点,与其他物种的D53蛋白均具有相同的保守结构域Clp B_D2-small;其二级结构仅有4种卷曲类型,以无规则卷曲最多,占42.77%,其次是α-螺旋,占35.55%,延伸链和β-转角分别占15.34%和6.34%。NpD53蛋白的氨基酸序列同源性比对及系统进化树分析结果显示,河八王与禾本科物种(高粱和山羊草)的亲缘关系较近,与海枣、油棕、芭蕉等物种的亲缘关系较远。【结论】河八王分蘖基因NpD53编码蛋白与其他物种的D53蛋白具有相同的保守结构域,且具有2个I类Clp ATP酶的非特异性位点,推测NpD53为一种分子伴侣,与河八王自身的耐热性相关。

甘蔗与河八王杂交后代染色体传递及河八王血缘在后代中的遗传

为探明甘蔗野生基因在杂交过程中的遗传情况,提高甘蔗野生种质资源的利用效率,本研究利用染色体计数法及AFLP结合荧光毛细管电泳技术,开展了甘蔗与河八王杂交的染色体传递和亲本特异位点在杂交种中的遗传分析。结果表明,甘蔗×河八王组合的F1染色体传递行为有n+n和n+2n方式,BC1是n+n方式;利用AFLP标记结合毛细管电泳技术开展了河八王野生基因在F1、BC1后代中的遗传分析,并利用24对AFLP引物组合对4个河八王F1后代、9个BC1后代及其双亲进行了扩增,共检测到总条带数1 774条,其中多态性条带1 690条,多态性检出率为95.26%,各引物组合多态性变幅为87.04%～100%。进一步分析表明,母本桂糖05-3256的特异位点传递给F1后代的比例是63.92%～71.65%,父本广西河八王1特异位点传递给F1后代的比例是8.66%～12.85%。母本崖城94-46特异位点传递给BC1后代的比例是35.19%～48.50%,父本T6-3特异位点传递给BC1后代的比例是33.97%～59.33%;广西河八王1特异位点传递到BC1后代时,比例仅为1.12%～3.35%。另外,F1、BC1的特异位点保持了较高水平。本研究说明了河八王作为父本进行杂交利用过程中,其野生基因在后代中丢失严重,在BC1已处于很低水平,建议前期将河八王作为母本杂交利用,可能会聚合更多有益的河八王野生血缘,从而改良甘蔗的抗逆性。

甘蔗与河八王杂交BC_1对黑穗病的抗性鉴定与初步评价

为研究甘蔗与河八王杂交BC1品系(SNBC1)对黑穗病的抗性水平,以广西蔗区甘蔗黑穗病混合孢子粉为接种源,利用人工浸渍接种与自然感病相结合的方法,对河八王BC1、黑穗病鉴定对照品种及亲本共38个材料进行黑穗病抗性鉴定。通过观测发病潜伏期、持续发病期、接种发病率、自然发病率这4个病情参数,结合对照品种的抗性表现,评价参试品系的抗性,并通过系统聚类分析验证。结果表明4个病情参数之间的相关性达极显著水平:SNBC1品系中:未发病品系7个,占18.42%;高抗(HR)的品系15个,占39.47%;抗(R)品系3个,占7.89%;中感(MS)品系有3个,占7.89%;感(S)品系有2个,占5.26%。系统聚类分析结果与SNBC1材料的抗性表现一致。

河八王杂交种F1、BC1及其亲本DNA甲基化水平和模式变化

为分析河八王及后代基因组DNA甲基化水平和遗传模式变化,以河八王及其后代F1和BC1为材料,采用甲基化敏感扩增多态性技术(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)结合毛细管电泳技术(Capillary electrophoresis,CE)分析亲本及后代基因组DNA甲基化水平和遗传模式变化规律。结果表明:母本‘GT05-3256’的MSAP比率是59.6%,父本‘GXN1’则是60.5%,其杂交种F1的MSAP比率是56.4%~59.0%,均低于双亲;BC1的母本‘YC94-46’的MSAP比率是59.4%,父本‘T6-3’则是59.0%,BC1MSAP比率是56.9%~69.8%,整体平均为62.8%,平均值高于双亲。BC1世代总甲基化水平略高于F1世代水平。F1和BC1基因组CCGG位点发生甲基化的方式整体上以内部胞嘧啶双链甲基化为主。在F1和BC1中均检测到70种甲基化类型,并进一步分为A、B、C、D和E等5大类,其中A类是亲本向杂交种的甲基化遗传类型;B类是去甲基化类型,表示杂交种相应于其亲本的甲基化减弱;C类是过或超甲基化类型,表示杂交种相应于其亲本的甲基化增强;D类是次甲基化类型,杂交后代甲基化水平比双亲均要低;E类为不定类型。结果显示,B、C、D、E是杂交种的甲基化变异类型;F1的甲基化遗传类型(A类)比例明显低于BC1,但变异类型B、C、D、E高于BC1;杂交形成F1和BC1过程中,基因组DNA普遍发生了超甲基化修饰。