内源性血管生成抑制因子A rresten在E.coli JM109中的表达及抗新生血管生成的药理学研究

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体，并进行表达，抑制新生血管的药理学实验中发现，该表达产物具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的功能。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA，经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出Arresten基因，构建重组质粒pBV220-Art转化E．coli JM109进行原核表达，大量表达提取Arresten蛋白，用鸡胚绒毛尿囊膜实验进行活性测定。结果成功构建的重组质粒pBV220-Arr在E．coli JM109菌株中2～8h均可获得表达，其中诱导4h表达效率最高，Arresten蛋白可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长，活性功能明显强于血管抑素。结论成功构建Arresten基因重组质粒pBV220-Arr，并可在E．coli JM109菌株中获得表达，Arresten蛋白具有明显的抑制血管生成的作用。

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

以纳豆芽孢杆菌HL-1全基因组DNA为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽及成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-NK),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因序列(pro-NK)和只编码成熟肽的纳豆激酶基因序列(NK),构建了大肠杆菌表达质粒pET28a-NK表达前纳豆激酶原基因及大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pHT315-NK表达纳豆激酶原基因和纳豆激酶基因,实现了纳豆激酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达,并进行了活性分析。

纳豆激酶基因在大肠杆菌中活性表达的比较研究

实现纳豆激酶基因 (nattokinasegene)在大肠杆菌中高活性表达 ,并说明前肽 ( pro序列 )对纳豆激酶的活性表达必不可少。以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板 ,采用PCR方法分别扩增编码信号肽、前肽及成熟肽的序列 ( pre pro NK)和编码前肽、成熟肽的序列 (pro NK) ,构建了大肠杆菌表达质粒 pTYB1 0 1 ,pTYB1 0 2 ,转化大肠杆菌ER2 5 66。在IPTG诱导下 ,分别在 1 5℃ ( 1 4h) ,3 0℃ ( 3h)和 3 7℃ ( 2h)培养。结果可见 ,pTYB1 0 2能表达有活性的纳豆激酶。SDS PAGE表明 ,1 5℃表达杂蛋白更少。薄层扫描显示表达的纳豆激酶占菌体总蛋白的 3 0 %以上。成功制备了表达纳豆激酶的工程菌。

人钙调素在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

利用基因重组技术,将经PCR扩增获得的人钙调素基因(hCaMcDNA)插入质粒pBV220,构建重组表达载体hCaM/pBV220,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆.阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDS-PAGE分析,可观察到一与CaM分子量相符(约17kD)的诱导表达条带,其表达量占菌体蛋白总量20%,并主要以可溶性形式表达.Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗人CaM单克隆抗体起特异反应.用Pheny1-SepharoseCL-4B疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物,每1L菌液可获CaM纯品3～4mg.重组人CaM(rhCaM)与牛脑CaM的氨基酸组成基本一致.生物活性测定结果提示,rhCaM具有激活NAD激酶的活性,其激活程度与标准人脑CaM几乎一致.

颗粒裂解肽G13结构域的表达及其对大肠杆菌活力的影响

目的构建携带颗粒裂解肽G13结构域的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达目的蛋白,并检测其对大肠杆菌活力的影响。方法人工合成G13结构域编码DNA序列,PCR扩增后,用T-A克隆法与pBAD/TOPOThioFusion表达载体连接。通过PCR鉴定及测序筛选阳性重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经阿拉伯糖诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况,同时监测诱导表达前后工程菌A600值的变化及菌液中的突变体。结果工程菌经诱导,表达出相对分子质量约15000的特异蛋白,表达量占菌体总蛋白的3%左右。随着外源蛋白的表达,菌液A600值下降,随后又缓慢上升。提取的质粒测序结果表明,其启动子的-35区和-10区均发生了突变,随着诱导时间的增加,突变细胞的比例不断增加。结论已成功构建了G13结构域原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出G13融合蛋白。该异源蛋白的表达导致工程菌的活力降低。

创伤弧菌溶细胞素基因在大肠杆菌中的表达及溶血活性鉴定

目的用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素,并对其溶血活性进行评价。为今后的免疫学活性研究和单克隆检测试剂盒的研发奠定基础。方法构建pET28a(+)-vvhA表达载体,对包涵体进行三步洗涤后,用金属亲合层析(HisTag)纯化重组蛋白,并用溶血试验验证重组蛋白活性。结果用基因工程的方法成功获得高表达、高纯度(纯度≥96%)重组蛋白VVC。利用兔红细胞溶血试验检测表明,重组蛋白具有溶血活性,其活性为0.2μg/HU。结论成功用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素并对其纯化、复性条件进行优化。

重组人ω-干扰素的制备及活性分析

目的:建立人ω-干扰素(hIFN-ω)的大肠杆菌表达系统,为人ω-干扰素的生产及临床应用奠定基础。方法:自抗凝血中提取人基因组DNA,PCR扩增人ω-干扰素成熟肽编码序列克隆入pGEM-T-easy载体,进一步构建表达型重组质粒pBV-IFN-ω,温度诱导表达,表达产物行SDS-PAGE及Western blot鉴定。溶解并复性包涵体,细胞病变抑制法测定表达产物的抗病毒活性。结果:DNA序列分析证实,重组质粒pBV-IFN-ω含有开放读码框架正确的人ω-干扰素成熟肽编码序列。SDS-PAGE显示,诱导表达碎菌后的沉淀中有大小约为20kD的外源蛋白,Western blot证明此外源蛋白为重组人ω-干扰素,并经体外活性测定证实有良好的抗病毒活性。结论:成功地构建了人ω-干扰素(IFN-ω)的大肠杆菌表达系统,表达出具有抗病毒活性的重组人ω-干扰素。

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5 h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.

胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究

通过PCR从大肠杆菌(E.coliK12)基因组DNA中扩增出胱硫醚β-裂解酶(Cystathionineβ-lyase,CBL)基因,构建了能高效表达CBL的重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-CBL)。重组菌在30℃、0.5 mmol.L-1IPTG存在条件下诱导9 h,可溶性CBL的表达量达18 mg.L-1,占到菌体可溶性总蛋白的23%。将重组菌超声破碎后上清液经His-Trap Fast Flow亲和层析一步纯化得到CBL,回收率为71%,纯度达到94%,纯化后的CBL单位酶活为134.6 U.mg-1。为防止CBL溶液冻融后发生聚沉,向纯化后的酶液中加入5%甘油,-20℃保存。重组酶的最适反应温度为35℃,酶活性稳定的温度范围为20～35℃。重组酶的最适反应pH值为8.0,4℃下在pH值8.0的缓冲溶液中保温10 h酶稳定性最高。重组酶的KmL-cystathionine值为3.78 mmol.L-1,VmaxL-cystathionine值为0.928 mmol.L-1.h-1。本研究建立了基于CBL催化反应产物丙酮酸与2,4-二硝基苯肼显色原理测定CBL酶活性的新方法。

大肠埃希菌Mn-SOD基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

目的实现Mn-SOD基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达,制备Mn-SOD的多克隆抗体。方法用PCR方法从一株野生型大肠埃希菌(E.coli)基因组中扩增Mn-SOD基因编码区,将它克隆到原核表达载体上进行大量表达和纯化,再用纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40d后取其血清,用Western-blot印迹实验测定抗体效果。结果SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细菌总蛋白的50%;黄嘌呤氧化酶法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物酶比活为3921.77U/mg,是对照BL21的276.77倍;并制备了高效价的多克隆抗体。结论该研究成功地构建了大肠埃希菌Mn-SOD基因高效原核表达系统,所表达的Mn-SOD具有良好的免疫原性和免疫反应性。

海洋假单胞杆菌褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的高效表达和活性检测

利用PCR方法从假单胞杆菌基因组DNA扩增胞外褐藻胶裂解酶的全基因和缺损片段，构建表达质粒pQE30-aly32和pQE30-aly165，并在大肠杆菌M15中成功表达。表达的重组蛋白大部分存在于包涵体中，经洗涤，变性和复性，镍柱亲和层析纯化，获得了电泳纯的Aly32和Aly165。酶活性检测发现，仅Aly165具有较强活性，108u／mg，该酶对poly（G）和poly（M）都有活性，对poly（M）更敏感。对表达体系进行优化，确定IPTG的最佳浓度为0．6mmol／L，最佳诱导菌液密度0D600为0．5～0.6，最佳表达时间为3h，28℃低温诱导可以提高重组辱白的可溶幛．可溶悻辱白相对轰狄量缺到25％．

纳豆激酶研究进展

对纳豆激酶的理化性质、基因与蛋白结构、纳豆激酶基因的克隆与表达及体外溶栓活性测定方面的研究进展进行了综述,并对纳豆激酶的发展前景进行了展望。

重组纳豆激酶的研究进展

纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶,具有较强的直接溶解血纤维蛋白的特性,与当前的溶栓药物相比具有诸多优点,已成为新型溶栓药物开发的焦点。本文首先简要介绍了纳豆激酶基因及纳豆激酶分子的理化特性和生物学功能,对当前国内外采用基因工程技术(密码子优化、点突变、高效表达系统构建等)重组表达纳豆激酶的研究进展进行了综述,分析了其中存在的主要问题和不足以及商业化生产重组纳豆激酶的可能性,对纳豆激酶在医药、食品等行业中的应用前景进行了展望。

兔防御素NP1在大肠杆菌中的表达

通过选用大肠杆菌偏好密码子对兔防御素基因进行改造,人工合成兔防御素基因并构建编码GST-NP1融合基因,从而在大肠杆菌中进行表达。研究表明:表达的蛋白质经过亲和层析洗脱纯化,SDS-PAGE电泳分析,在目的分子量处出现预期条带。灰度扫描分析表明,表达量最高可达细菌总蛋白的34.7%。经切割、复性后的防御素具有溶血活性。

创伤弧菌溶细胞素在大肠杆菌中的表达及其对应激因子的调控

目的:用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素,对其溶血活性进行评价。并观察其作用肝癌细胞SMMC7721后,调控肝癌细胞SMMC772应激因子基因表达情况。方法:构建pET28a(+)-vvhA表达载体,对包涵体进行三步洗涤后,用金属亲和层析(6×His Tag)纯化重组创伤弧菌溶细胞素(rVVC),并用溶血试验验证重组蛋白活性。复性重组蛋白作用肝癌细胞SMMC7721后,RT-PCR方法检验SMMC7721细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、热休克蛋白90(HSP90)基因分泌调节情况。结果:用基因工程的方法成功获得高表达、高纯度(纯度≥96%)rVVC。兔红细胞溶血试验检测表明,rVVC具有溶血活性,其活性为0.2μg/HU(溶血单位)。RT-PCR结果显示,rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90 mRNA表达能力,但具有时间、剂量依赖性。结论:表达、纯化并复性的rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90 mRNA表达。提示rVVC在组织细胞损伤过程中发挥了应激作用。

人源可溶性B淋巴细胞刺激因子在大肠埃希菌中的类泛素蛋白融合表达及鉴定

目的 B淋巴细胞刺激因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)作为肿瘤坏死因子(tumor necrosing factor,TNF)家族的成员,在B细胞增殖和成熟方面具有重要作用,其缺陷和过表达均能引起机体免疫失衡,诱发自身免疫性疾病,因此获得纯化BAFF蛋白对研究其功能尤为重要。文中采用类泛素蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)融合表达系统,构建pET28a/SUMO-BAFF表达载体,经诱导表达和酶切获得纯度较高的人源B淋巴细胞刺激因子(human soluble BAFF,hsBAFF)蛋白,为进一步研究其免疫调节作用奠定了基础。方法 Over-lap PCR方法连接hsBAFF和SUMO基因,构建融合蛋白表达载体pET28a/SUMO-BAFF,测序鉴定后转化至大肠埃希菌,经半乳糖苷诱异剂(isopropul-betaD-thiogalactoside,IPTG)诱导表达和Ni2+-IDA Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化蛋白SUMO-hsBAFF,后经SUMO特异性蛋白酶切割和Ni2+-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化获得hsBAFF蛋白。结果测序证实pET28a/SUMO-BAFF表达载体构建成功,SDS-PAGE与Western blot鉴定获得纯化的融合蛋白SUMO-hsBAFF和经酶切后高纯度的蛋白hsBAFF。结论 SUMO融合表达系统能获得高表达的可溶性目的蛋白,纯化过程简单、高效,为进一步研究蛋白质结构和药物开发奠定基础。

重组人G-CSF双体分子的构建表达及生物活性和结构特性分析

研究目的是分子设计并构建较G-CSF单体分子具有半衰期更长、生物活性更高的新型重组人G-CSF/G-CSF双体分子(简称G-G),并在原核系统进行高效表达。分别构建pET32/G-G和pET32/G原核表达载体,实现G-G双体融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白纯化;对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性、抗原性及亲水性进行模拟分析;采用MTT法对G-G双体融合蛋白的生物学活性进行测定。结果首次构建成功了G-G双体分子融合蛋白高效表达载体,表达量高于40％,一步亲和层析所获融合蛋白的纯度为80％左右。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,G-CSF双体分子的等电点、柔性、抗原性及亲水性均未显著改变。活性测定表明,所构建表达的重组人G-G双体分子能有效刺激G-CSF依赖细胞株NFS-60的增殖,但其刺激效应低于G-CSF的单体和标准品。结果表明,所构建表达的G-CSF的单体和G-G双体分子均可在大肠杆菌中获得高效表达,但G-G双体分子的比活性不及G-CSF单体分子,与预期设想的有差别,其原因正在研究之中。

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/复性、DEAE-Sepharose Fast Flow纯化和自催化后检测凝乳活性。结果表明,重组凝乳酶原基因在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的68%,采用Arima K方法检测,其凝乳活力达到80 SU/mL。因此,通过大肠杆菌表达系统大量制备具有生物活性的重组牛凝乳酶原的策略是可行的,研究结果为弥补国内天然牛凝乳酶的短缺提供一种途径。

乳酸克鲁维斯酵母乳糖酶基因的克隆及原核表达

从乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyceslactis)菌株k538中克隆获得乳糖酶基因klac,并将其插入到表达载体pET-30a(+)上构建重组表达质粒pETlac4。将pETlac4电击转化到大肠杆菌BL21中,分别研究了阳性转化子在28℃,37℃下经IPTG诱导3h后的蛋白表达情况。表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,klac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0.475U/mL,37℃仅为0.134U/mL。

创伤弧菌溶细胞素vvhA基因在大肠杆菌中的表达及其对应激因子的调控

目的用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素，对其溶血活性进行评价。并观察其作用肝癌细胞SMMC7721后，调控肝癌细胞SMMC7721应激因子基因表达情况。方法构建pET28a（＋）-whA表达载体，对包涵体进行三步洗涤后，用金属亲和层析（6×HisTag）纯化重组创伤弧菌溶细胞素（rVVC），并用溶血试验验证重组蛋白活性。复性重组蛋白作用肝癌细胞SMMC7721后，RT-PCR方法检验SMMC7721细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）、热休克蛋白90（HSP90）基因分泌调节情况。结果用基因工程的方法成功获得高表达、高纯度（纯度≥96％）rVVC。兔红细胞溶血试验检测表明，rVVC具有溶血活性，其活性为0．2μg／HU（溶血单位）。RT-PCR结果显示，rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90 mRNA表达能力，但具有时间、剂量依赖性。结论表达、纯化并复性的rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90mRNA表达。提示rVVC在组织细胞损伤过程中发挥了应激作用。