自然杀伤细胞家族2成员D受体-配体轴在血液瘤中的作用研究进展

自然杀伤细胞家族2成员D(NKG2D)受体通过表达在自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴(CTLs)细胞上激活这些免疫细胞对抗肿瘤。肿瘤细胞通过降低自然杀伤细胞家族2成员D配体(NKG2DLs)的表达来逃避免疫系统的监视,从而促进肿瘤的免疫逃逸。最新的研究揭示了NKG2D受体-配体轴在血液瘤的发展、免疫监视和治疗中的关键作用,尤其是在阐明免疫逃逸机制和开发新的治疗策略方面显示出巨大潜力。现从NKG2D受体-配体轴在血液瘤发病机制、免疫监测及治疗中的作用进行阐述,在加深对血液瘤病理机制理解的同时,为提升治疗效果开辟了新的策略。

CD4^(+)NKG2D^(+)T细胞在幼年特发性关节炎疾病活动中的作用

目的分析幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis,JIA)活动期及稳定期CD4^(+)NKG2D^(+)T细胞及NKG2D可溶性配体,即可溶性MHC-Ⅰ类链相关分子A和B(soluble MHC classⅠchain-related molecules A/B,sMICA/sMICB)表达水平,探讨其在JIA疾病活动中的作用。方法前瞻性纳入2019年11月—2021年12月重庆医科大学附属儿童医院确诊的全身型JIA 19例和关节型JIA 20例,6例健康儿童为对照组。收集外周血标本,采用酶联免疫吸附法测定sMICA和sMICB水平,采用流式细胞术检测CD4^(+)NKG2D^(+)T细胞比例,采用全身型幼年关节炎疾病活动评分-27(systemic Juvenile Arthritis Disease Activity Score,sJADAS-27)/幼年关节炎疾病活动评分-27(Juvenile Arthritis Disease Activity Score-27,JADAS-27)评估JIA患儿的疾病活动性。采用Pearson相关分析法、受试者工作特征曲线分析CD4^(+)NKG2D^(+)T细胞及sMICA、sMICB在JIA疾病活动中的作用。结果全身型JIA活动期组及关节型JIA活动期组CD4^(+)NKG2D^(+)T细胞比例较对照组及各自稳定期组升高(P<0.05)。JIA各组sMICA和sMICB水平均高于对照组(P<0.05)。关节型JIA活动期组sMICB水平高于关节型JIA稳定期组(P<0.05)。JIA患儿CD4^(+)NKG2D^(+)T细胞比例及sMICA、sMICB水平与sJADAS-27/JADAS-27评分呈正相关(P<0.05)。sMICB对JIA疾病活动性评估的曲线下面积为0.755,特异度为0.90,灵敏度为0.64。结论JIA患儿CD4^(+)NKG2D^(+)T细胞比例及sMICA、sMICB水平较健康儿童升高,且与疾病活动性呈正相关,提示CD4^(+)NKG2D^(+)T细胞及NKG2D配体可作为JIA疾病活动性评估的新指标。

分子靶向药物诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达

目的:探讨不同分子靶向药物对高表达与低表达ATP结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette super-family Gmember 2,ABCG2)的人耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞(分别简写为ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP)表面NKG2D配体(natural killer group 2 member Dligands,NKG2DLs)表达的诱导作用及其对NK细胞杀伤敏感性的影响。方法:免疫磁珠法分选ABCG2highCNE2/DDP、ABCG2lowCNE2/DDP细胞及NK细胞。流式细胞术检测分选细胞的纯度和不同分子靶向药物(硼替佐米、索拉非尼、舒尼替尼)处理前后ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达率。LDH释放法检测不同药物处理前后ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞对NK细胞杀伤的敏感性。结果:ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞表面ABCG2的表达率分别为(91.40±2.32)%和(1.70±0.24)%。分选后NK细胞中CD3-CD16+CD56+细胞的比例达90%以上。药物处理前,ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3呈弱表达;经不同分子靶向药物处理后,5种NKG2DLs的表达率均明显上升(P<0.01),以舒尼替尼处理后NKG2DLs的表达率升高最明显。随着NKG2DLs表达的上调,ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞对NK细胞杀伤的敏感性也随之升高。结论:不同分子靶向药物可诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,以舒尼替尼的诱导作用最强,且肿瘤细胞NKG2DLs的表达与其对NK细胞杀伤敏感性之间存在线性关系。

舒尼替尼诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞表达NKG2DLs的机制

目的:初步探讨舒尼替尼诱导高、低表达ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G member 2)分子的耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞(简称ABCG2high CNE2/DDP细胞、ABCG2low CNE2/DDP细胞)中NKG2D配体(natural killer group 2 member Dligands,NKG2DLs)表达的分子机制。方法:Caspase-8活化试剂盒和线粒体膜电位法分别检测NK细胞处理后ABCG2highCNE2/DDP细胞和ABCG2lowCNE2/DDP细胞caspase-8活化水平和线粒体膜电位。RT-PCR检测舒尼替尼处理前后两种CNE2/DDP细胞DNA损伤修复系统相关信号分子mRNA的表达。结果:CNE2/DDP细胞+NK细胞组中两种CNE2/DDP细胞caspase-8活性均明显增强;舒尼替尼处理后的ABCG2lowCNE2/DDP细胞+NK细胞组和ABCG2highCNE2/DDP细胞+NK细胞组中caspase-8的活性是处理前的2～2.5倍(P<0.01)。舒尼替尼预处理后,CNE2/DDP细胞和NK细胞共培养体系中两种CNE2/DDP细胞的线粒体膜电位分别为(76.58±2.32)%和(73.11±1.93)%,较舒尼替尼处理前明显降低(P<0.05)。舒尼替尼可上调两种CNE2/DDP细胞中ATR、CHK1和CHK2 mRNA的表达,并诱导P53和NF-κB mRNA的表达。结论:舒尼替尼可能通过激活DNA损伤修复系统相关信号分子和NF-κB的表达,诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,同时经由死亡受体信号通路和线粒体信号通路增强NK细胞诱导的肿瘤细胞凋亡。

舒尼替尼促进HepG2细胞NKG2DLs表达从而增强NK细胞杀伤活性

目的:探讨舒尼替尼促进肝癌细胞自然杀伤细胞2族成员D配体(natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs)表达及提高NK细胞杀伤肿瘤细胞的作用。方法:常规体外培养HepG2细胞,免疫磁珠法从健康志愿者外周静脉血中分选NK细胞,流式细胞技术检测NK细胞纯度及1μmol/L舒尼替尼孵育24 h前后肝癌细胞NKG2DLs表达率;LDH释放测定法检测NK细胞对药物处理前后靶细胞的杀伤活性,实时荧光定量PCR检测药物处理前后HepG2细胞NKG2DLs mRNA的表达情况。结果:分选后NK细胞(CD3^-CD16^+CD56^+细胞)的纯度达78%以上;经舒尼替尼处理后靶细胞MHC-Ⅰ类链相关分子A或B(MHC classⅠ-related chain molecules A/B,MICA/MICB)、人巨细胞病毒糖蛋白UL16结合蛋白(UL16-binding proteins,ULBPs)的表达率均有升高,以MICA、MICB和ULBP2升高最明显(F=17.73,P=0.000)。当效靶比为10∶1、20∶1时,NK细胞对舒尼替尼处理前后HepG2细胞的杀伤活性分别从(9.47±1.11)%、(20.45±1.94)%上升到(28.88±1.23)%、(44.93±1.57)%,舒尼替尼处理前后NK细胞对靶细胞杀伤活性的差异有明显统计学意义(P<0.05)。舒尼替尼处理HepG2细胞后,MICA、MICB和ULBP2 mRNA表达水平明显升高(F=62.628,P=0.000)。结论:舒尼替尼能选择性诱导肿瘤细胞高表达NKG2DLs(MICA/B和ULBP2),并增强NK细胞杀伤活性。

舒尼替尼体内诱导耐药鼻咽癌细胞表达NKG2DLs增强NK细胞的抑瘤作用

目的:探讨体内条件下舒尼替尼对耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs(natural killer group 2 member D ligands)表达的诱导作用,及其对NK细胞抗肿瘤活性的影响。方法:建立ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分如下8组:A、E组分别接种ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞,B、F组分别接种舒尼替尼处理的ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞,C、G组分别接种ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞后再输注NK细胞;D、H组接种舒尼替尼处理的ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞后再输注NK细胞。检测各组裸鼠成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积和抑瘤率。免疫组织化学法检测移植瘤组织中NKG2DLs的表达。结果:A、B、C、D和E、F、G、H组肿瘤出现时间分别为(5.43±1.00)、(8.50±0.35)、(11.10±1.25)、(13.56±1.23)d和(9.00±1.00)、(12.30±0.78)、(14.50±0.50)、(17.25±0.77)d,其中舒尼替尼与NK细胞联合处理组(D和H组)成瘤时间最晚(P<0.01)。A、B、C、D和E、F、G、H组肿瘤质量分别为(2.63±0.89)、(1.00±0.03)、(0.65±0.08)、(0.21±0.27)g和(2.79±0.83)、(1.18±0.77)、(0.96±0.50)、(0.86±0.82)g,其中舒尼替尼与NK细胞联合处理组肿瘤质量最小(P<0.01);舒尼替尼与NK细胞联合处理的D组和H组的抑瘤率分别为92%和69%。舒尼替尼上调移植瘤组织中NKG2DLs的表达,且ABCG2highCNE2/DDP细胞移植瘤中的NKG2DLs表达率高于ABCG2lowCNE2/DDP细胞。结论:舒尼替尼可在体内诱导CNE2/DDP移植瘤组织表达NKG2DLs,增强NK细胞的抗肿瘤作用。

西妥昔单抗对耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞和NK细胞的双重免疫调节作用

目的:探讨西妥昔单抗(cetuximab)对耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2D配体(natural killer group 2 member Dligands,NKG2DLs)的表达及NK细胞分泌IFN-γ的影响。方法:流式细胞术检测高、低表达ABCG2(ATP-binding cassettesuperfamily G member 2)的耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞(简称ABCG2lowCNE2/DDP细胞和ABCG2highCNE2/DDP细胞)表面EGFR的表达水平,以及西妥昔单抗处理前后两种CNE2/DDP细胞表面NKG2DLs的表达水平。西妥昔单抗处理前后的两种CNE2/DDP细胞分别与NK细胞共培养,ELISA检测上清中IFN-γ的分泌水平,LDH释放法检测NK细胞对不同组CNE2/DDP靶细胞的杀伤。结果:ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞表面EGFR的表达率分别为(43.60±2.01)%和(47.20±2.07)%。西妥昔单抗上调ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞表面MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的表达,但下调ABCG2highCNE2/DDP细胞表面ULBP3的表达。西妥昔单抗处理两种CNE2/DDP细胞后,与NK细胞的共培养体系中IFN-γ的分泌水平明显上调(P<0.01);西妥昔单抗增强两种CNE2/DDP细胞对NK细胞杀伤的敏感性(P<0.01)。结论:西妥昔单抗可上调耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,间接刺激NK细胞分泌IFN-γ,具有双重免疫调节作用。

主要组织相容性复合体-Ⅰ类分子链相关蛋白A-自然杀伤细胞2族成员D通路及其在头颈部鳞状细胞癌中的研究进展

主要组织相容性复合体-Ⅰ类分子链相关蛋白A(MICA)作为自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)的配体,与其特异性结合,活化以自然杀伤细胞为主的免疫效应细胞,发挥免疫监视作用。本文就近5年来有关MICA-NKG2D通路的表达、调控及其在头颈部鳞状细胞癌中的研究进展作一综述。

自然杀伤细胞2族成员D及其配体在口腔肿瘤中的免疫调节作用

在人类,口腔恶性肿瘤十分常见且发病率高,对人类的健康和生命构成了极大的威胁。自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)与其配体主要组织相容性复合体1类相关分子结合可激活自然杀伤细胞,在肿瘤发生的早期启动机体的固有免疫监视和清除作用。NKG2D的配体主要有主要组织相容性复合体1类相关分子A和B以及UL16结合蛋白,深入研究NKG2D及其配体在口腔肿瘤免疫中的调节作用,有助于发掘新的有效对抗口腔肿瘤的治疗方式。本文就NKG2D及其配体在口腔肿瘤免疫中的调节作用等研究进展作一综述。

Why natural killer cells in triple negative breast cancer?

The triple-negative subtype of breast cancer(TNBC)has the bleakest prognosis,owing to its lack of either hormone receptor as well as human epidermal growth factor receptor 2.Henceforth,immunotherapy has emerged as the front-runner for TNBC treatment,which avoids potentially damaging chemotherapeutics.However,despite its documented association with aggressive side effects and developed resistance,immune checkpoint blockade continues to dominate the TNBC immunotherapy scene.These immune checkpoint blockade drawbacks necessitate the exploration of other immunotherapeutic methods that would expand options for TNBC patients.One such method is the exploitation and recruitment of natural killer cells,which by harnessing the innate rather than adaptive immune system could potentially circumvent the downsides of immune checkpoint blockade.In this review,the authors will elucidate the advantageousness of natural killer cell-based immuno-oncology in TNBC as well as demonstrate the need to more extensively research such therapies in the future.

舒尼替尼诱导自然杀伤细胞2族成员D配体表达对自然杀伤细胞杀伤舌鳞癌CAL27细胞敏感性的影响

目的探讨舒尼替尼诱导自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体(NKG2DL)的表达对自然杀伤(NK)细胞杀伤舌鳞癌CAL27细胞敏感性的影响。方法将对数生长期的CAL27细胞分为未处理组和舒尼替尼组,舒尼替尼组采用舒尼替尼处理,未处理组细胞未经舒尼替尼处理。采用细胞克隆形成实验检测两组CAL27细胞的增殖能力;采用流式细胞术检测两组CAL27细胞的凋亡、NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3)阳性细胞的表达及健康人NK细胞的纯度;采用免疫蛋白印迹法检测两组CAL27细胞中NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3)蛋白的表达水平。再将舒尼替尼组分为舒尼替尼-NKG2D组和舒尼替尼-对照组,舒尼替尼-NKG2D组加入经NKG2D单抗处理后的NK细胞,舒尼替尼-对照组加入未经NKG2D单抗处理的NK细胞,同时未处理组加入未经NKG2D单抗处理的NK细胞(作为未处理-NK组)。采用乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞对CAL27细胞的杀伤敏感性。结果(1)与未处理组相比,舒尼替尼组CAL27细胞的增殖能力降低、凋亡率增加,CAL27细胞中的MICA、MICB、ULBP1和ULBP2蛋白表达水平均升高(均P<0.05),而两组CAL27细胞ULBP3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。(2)与未处理-NK组相比,NK细胞对经舒尼替尼处理的CAL27细胞的杀伤敏感性增强(均P<0.05)。(3)采用NKG2D抗体封闭NK细胞表面的NKG2D受体后,NK细胞对经舒尼替尼处理的CAL27细胞的杀伤敏感性低于未采用NKG2D单抗处理的CAL27细胞的杀伤敏感性(均P<0.05)。结论舒尼替尼可以抑制舌鳞癌细胞CAL27细胞的增殖,促进其凋亡,上调CAL27细胞中NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2)的表达水平,增强NK细胞对CAL27细胞的杀伤敏感性。

厄洛替尼作用后表皮生长因子受体突变的人肺腺癌HCC827细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞的杀伤敏感性

目的观察表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼及EGFR下游主要分子对人肺腺癌HCC827细胞表面NKG2D配体表达的影响,探讨厄洛替尼作用于肺腺癌HCC827细胞后,细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞对HCC827细胞杀伤活性的变化。方法 HCC827细胞分为空白对照组及厄洛替尼5、10μmol·L-1组,应用流式细胞仪检测细胞表面NKG2D配体主要组织相容性复合体I类链相关蛋白(MIC)A、B及UL16结合蛋白(ULBP)1、2、3的表达。HCC827细胞培养24 h后,分别以EGFR下游分子磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂LY294002、丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580、信号传导及转录激活因子3抑制剂STAT21、蛋白激酶C抑制剂Rottlerin进行作用,应用流式细胞仪分析HCC827细胞表面NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达,并与空白对照组进行比较。乳酸脱氢酶释放法检测CIK细胞对空白对照组和厄洛替尼组HCC827细胞的杀伤活性。结果与空白对照组比较,厄洛替尼5、10μmol·L-1组HCC827细胞表面NKG2D配体MICB、ULBP1表达显著增高(P<0.05),MICA、ULBP2、ULBP3表达差异无统计学意义(P>0.05);厄洛替尼5μmol·L-1组与10μmol·L-1组比较,HCC827细胞表面NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达差异均无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组比较,SB203580组的HCC827细胞表面NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达差异无统计学意义(P>0.05),STAT21组的HCC827细胞表面NKG2D配体MICA、MICB表达显著增高(P<0.05),LY294002组的HCC827细胞表面NKG2D配体MICA表达显著降低(P<0.05),Rottlerin组的HCC827细胞表面NKG2D配体ULBP1表达显著增高(P<0.05)。同一效靶比时,CIK细胞对厄洛替尼作用后组HCC827细胞的杀伤率均显著高于未经药物作用组(P<0.05)。效靶比20∶1时经NKG2D单抗封闭后的CIK细胞对未经药物作用组和10μmol·L-1厄洛替尼作用后组HCC827细胞的杀伤率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论厄洛替尼能增高HCC827细胞表面NKG2D配体表达,增强CIK细胞的杀伤活性。

miR-20a/106b调控NKG2D途径介导儿童型脑干胶质瘤免疫逃逸的实验研究

目的探讨miR-20a/106b在儿童脑干胶质瘤(BSG)恶性进展中的作用及其机制。方法回顾性纳入2012年1月至2017年12月天津市环湖医院(天津市脑系科中心医院)神经外科接受手术切除的13例儿童BSG患者和5例成人BSG患者。采用免疫组织化学染色法检测肿瘤组织标本中自然杀伤细胞2家族成员D(NKG2D)配体MICA的表达情况,采用生物信息学方法筛选出调控MICA的miRNA。应用人脑胶质瘤LN229和U251细胞株通过荧光素酶报告基因方法验证筛选出的miRNA与MICA的靶向调控关系,通过蛋白质免疫印迹(WB)实验检测miR-20a/106b转染LN229和U251细胞株后MICA的表达情况,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫细胞对LN229细胞株的毒性能力。通过向去胸腺幼年(3周龄)和成年(10周龄)雄性SD大鼠脑桥区立体定向注射LN229细胞株的方法制备BSG幼鼠(J-rat)和成年鼠(A-rat)模型,并根据注射细胞株不同各分为3组,依次为J-rat组、J-rat-scr组、J-rat-miR-20a/106b-d组和A-rat组、A-rat-scr组、A-rat-miR-20a/106b-u组(每组各3只),通过免疫组织化学染色方法检测MICA的表达情况,采用MCID软件检测肿瘤的侵袭性,采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果成人患者的MICA总阳性表达率较儿童患者高(分别为5/5、10/13,P<0.05)。检索结果显示,有23个可能调控MICA的microRNA,其中包括miR-20a和miR-106b。在LN229细胞株中,荧光素酶报告基因结果显示,转染pGL3-MICA-wt(野生型)质粒的荧光强度较对照组和转染pGL3-MICA-mut(突变型)质粒的强(均P<0.05);WB结果显示,与空白对照组和无义序列组比较,AS-miR-20a组、AS-miR-106b组及AS-miR-20a/106b组MICA的表达均增加(均P<0.05)。上述实验在U251细胞株得到相似的结果。不同效靶比(20∶1,10∶1,5∶1)情况下,AS-miR-20a/106b组LDH的活性高于对照组和AS-miR-20a/106b+MICA mAb组(均P<0.05),但后两组的差异无统计学意义(均P>0.05)。术后头颅MRI结果显示,3组幼鼠和3组成年鼠均成功制备脑干胶质瘤模型。MCID软件检测结果显示,J-rat-miR-20a/106b-d组I值较J-rat组、J-rat-scr组均降低(均P<0.05);A-rat-miR-20a/106b-u组I值较A-rat组、A-rat-scr组均增加(均P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示,J-rat-miR-20a/106b-d组的MICA染色强度均较J-rat组和J-rat-scr组增加(均P<0.05),A-rat-miR-20a/106b-u组MICA的染色强度均较A-rat组和A-rat-scr组降低(均P<0.05)。体内凋亡实验显示,J-rat-miR-20a/106b-d组的细胞凋亡指数均较J-rat组和J-rat-scr组增加(均P<0.05),A-rat-miR-20a/106b-u组的细胞凋亡指数较A-rat组和A-rat-scr组均降低(均P<0.05)。结论miR-20a/106b通过NKG2D途经达到的免疫逃逸是导致儿童型BSG恶性度高的重要原因。

MICB/NKG2D信号通路在免疫逃逸中的研究进展

自然杀伤细胞2族成员D(natural killer group 2 member D,NKG2D)是由NK细胞表达的一种免疫受体,可识别靶细胞表面上的人类主要组织相容性复合体Ⅰ类多肽相关序列(major histocompatibility complex Class I polypetide-related chain,MIC)A/B。NKG2D与MICA/B的相互作用,在病毒感染和癌症的免疫监视中发挥重要作用。该文通过膜结合型MICB下调、分泌型MICB增多及MICB基因多态性三部分对MICB/NKG2D信号通路在免疫逃逸中的研究进展进行综述。

多靶点酪氨酸激酶抑制剂联合NK细胞的抗肝癌作用及其分子机制

目前,针对晚期肝癌无标准和令人满意的治疗方法。多靶点酪氨酸激酶抑制剂(multi-target tyrosine kinase inhibitor,MTKI)联合NK细胞对肝癌细胞具有协同杀伤作用:一方面,MTKI能阻断肿瘤细胞增殖和血管生成信号通路促进细胞凋亡;另一方面,MTKI诱导肿瘤细胞表达NK细胞活化性配体(natural killer group 2 member D ligand,NKG2DL),促进肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性。MTKI诱导肿瘤细胞表达NKG2DL,主要通过DNA损伤修复反应分子和细胞凋亡通路与转录因子NF-κB(nuclear factor-κB)之间相互作用,活化由NF-κB2和Rel B组成的旁路途径调节NKG2DL的转录和表达。MTKI通过NF-κB旁路途径诱导肿瘤表达NKG2DL的分子机制为MTKI联合NK细胞治疗肝细胞癌提供了理论依据。

分娩发动前后体内NK细胞、NKT细胞表型分析

目的研究分娩发动前后蜕膜及外周血中NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体的表达情况,探讨其在产程发动中的作用。方法选取正常孕足月孕妇分为分娩发动经阴道分娩组(以下简称分娩组20例)和分娩未发动行选择性剖宫产术组(以下简称剖宫产组20例),分离蜕膜及外周血中单个核细胞后采用流式细胞学技术分别检测CD56+细胞、NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体的表达情况。结果外周血单个核细胞中分娩组CD56+NKG2A+细胞构成下降、CD56+NKG2D+细胞构成增加,NK细胞、NKT细胞表面NKG2D表达上升。蜕膜单个核细胞中分娩组CD56+NKG2A+和CD56+NKG2D+细胞构成及NK细胞表面NKG2A和NKG2D表达均下降,NKT细胞表面NKG2A和NKG2D表达无显著差异。结论临产前体内NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体表达的变化可能在在产程的发动中起着重要作用。

生长激素对人外周血来源NK细胞杀伤活性的影响及机制探讨

目的观察生长激素(GH)对人外周血来源自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响,并探讨其机制。方法选取10名健康志愿者,采用免疫磁珠法分离并培养其外周血NK细胞。将NK细胞分为A、B、C组,分别与终浓度0、5、20μg/mL的重组人GH共培养48 h。以人类髓性白血病K562细胞为靶细胞,NK细胞为效应细胞,按不同的效靶比(25∶1、50∶1、100∶1)混合,采用CCK-8法检测NK细胞对K562细胞的杀伤率;取各组培养48 h的NK细胞,分别采用流式细胞术和Real-time RT-PCR法检测NK细胞表面活化受体NKG2D蛋白及基因。结果三个不同效靶比下,B、C组NK细胞对K562细胞的杀伤率高于A组,且C组高于B组(P均<0.01)。A、B、C组NKG2D阳性表达的NK细胞百分数分别为78.8%±2.8%、87.5%±3.1%、91.8%±3.3%,B、C组NKG2D阳性表达的NK细胞百分数高于A组(P均<0.05)。A、B、C组NKG2D mRNA相对表达量分别为1±0.01、5±2.32、10±3.21,B、C组NKG2D mRNA相对表达量高于A组,且C组高于B组(P均<0.05)。结论 GH可通过上调NK细胞NKG2D的表达,增强其杀伤活性。

NK细胞活化性受体及其配体在缺血性脑卒中模型小鼠脑组织中的表达变化

目的探讨NK细胞活化性受体(NKG2D)信号通路在缺血脑组织中的表达及其在缺血性脑损伤中的潜在作用。方法采用双侧颈总动脉持久性结扎法(2VO),构建C57BL/6雄性小鼠全脑缺血再灌注损伤模型组(2VO组)和假手术对照组(Sham组),每组12只。脑缺血20 min、再灌注72 h后,处死小鼠收集大脑,Nissl染色观察海马CA1区和纹状体CPu区神经元的损伤程度,实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹技术检测缺血脑组织中NKG2D及其配体(H60、Rae-1、Mult1)的表达,实时荧光定量PCR法检测NKG2D受体下游接头蛋白DAP10及促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS)的mRNA表达。结果Nissl染色结果显示,2VO组小鼠海马CA1区和纹状体CPu区的神经元严重损伤(P<0.001);2VO组小鼠缺血脑组织中NKG2D及其3种配体的mRNA水平和蛋白表达水平均高于Sham组(P<0.05);下游接头蛋白DAP10以及促炎因子的mRNA水平均明显高于Sham组(P<0.05)。结论脑缺血介导的NKG2D受体信号通路激活可能在小鼠脑缺血损伤炎症反应中发挥重要作用。

香砂六君子汤合除痰解毒中药对Lewis肺癌小鼠免疫逃逸的影响

目的:观察香砂六君子汤合除痰解毒中药对Lewis肺癌小鼠免疫逃逸的作用及机制。方法:取60只SPF级C57BL/6J雄鼠,于右侧腋中线皮下注射Lewis细胞悬液0.2 m L(含细胞数2×10^(6)个/m L),接种7 d后,将造模成功的小鼠随机分为模型组、顺铂组、香砂六君子汤低、中、高剂量组、联合组,每组10只。香砂六君子汤低、中、高剂量组分别灌胃17.88、35.75、71.50 g·kg^(-1)香砂六君子汤加减溶液,1次/d,顺铂腹腔注射小鼠用量换算为5 mg·kg^(-1),2次/周,各组均连续干预14 d,每2 d测量肿瘤体积。治疗结束后称取各组小鼠肿瘤质量并计算抑瘤率;苏木素-伊红(HE)染色观察各组肿瘤的形态学特征;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组肿瘤组织中自然杀伤(NK)细胞杀伤受体2(NKG2D)、核糖核酸输出因子-1(RAE-1)、γ干扰素(IFN-γ)mRNA含量;免疫组化法(IHC)、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组肿瘤RAE-1、NKG2D、IFN-γ表达;Western blot检测各组小鼠肿瘤中IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及脾脏组织中NKG2D、RAE-1蛋白含量。结果:与模型组比较,香砂六君子汤各剂量组肿瘤质量均下降,差异无统计学意义;肿瘤体积均缩小(P<0.05,P<0.01);病理学形态改善;香砂六君子汤中剂量组NKG2D、RAE-1、IFN-γ mRNA含量均升高(P<0.05,P<0.01),肿瘤组织中NKG2D、RAE-1、IFN-γ蛋白表达均升高(P<0.05,P<0.01),p-JAK2、p-STAT3蛋白表达下降(P<0.05,P<0.01);脾脏组织中,香砂六君子汤各剂量组NKG2D、RAE-1蛋白表达均显著升高(P<0.01)。与顺铂组比较,香砂六君子汤中剂量组NKG2D、RAE-1、IFN-γ mRNA含量升高,差异无统计学意义;IHC显示联合组NKG2D、IFN-γ蛋白表达显著升高(P<0.01),Western blot结果表明RAE-1、NKG2D、IFN-γ蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01);联合组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达下降(P<0.05,P<0.01);脾脏组织中,香砂六君子汤中剂量组、联合组NKG2D、RAE-1蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:香砂六君子汤合除痰解毒中药能够通过上调RAE-1/NKG2D表达,促进NK细胞活化,抑制免疫逃逸,抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长,其机制可能与下调JAK2/STAT3通路相关。

清除Vγ4T细胞在小鼠皮肤紫外线损伤后表皮组织修复中的作用及其机制

目的探究清除Vγ4T细胞在小鼠皮肤紫外线损伤后表皮组织修复中的作用及其机制。方法该研究为实验研究。将54只6~8周龄雌性C57BL/6J野生型小鼠按照随机数字表法分为Vγ4T细胞清除组和对照组(每组27只),分别腹腔注射亚美尼亚仓鼠抗小鼠Vγ4T细胞受体(TCR)单克隆抗体200µg、等量同型对照IgG抗体。注射后1周(之后均在此时间点取小鼠),每组取3只小鼠(之后均从这2组另取小鼠),从背部皮肤组织和腋窝、腹股沟淋巴结中分别提取真皮细胞和淋巴结细胞,行流式细胞术检测真皮细胞和淋巴结细胞中Vγ4T细胞比例;每组取5只小鼠,观察背部皮肤情况,之后行苏木精-伊红(HE)染色观察皮肤组织结构并测量表皮组织厚度;每组取5只小鼠,提取表皮细胞后行流式细胞术检测表皮细胞中树突状表皮T细胞(DETC)比例。每组取3只小鼠,分别设为Vγ4T细胞清除+5次紫外线辐射(UVR)组和对照+5次UVR组,每日1次共行5次UVR,每日照射后即刻观察背部皮肤情况;每组取5只小鼠,分别设为Vγ4T细胞清除+1次UVR组和对照+1次UVR组,均行1次UVR后即刻行HE染色后测量表皮组织厚度。每组取3只小鼠,分别设为单纯Vγ4T细胞清除组、单纯对照组;再另取3只小鼠,分别设为Vγ4T细胞清除+1次UVR组和对照+1次UVR组;均同前处理后,采用实时荧光定量反转录PCR法检测表皮组织中胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、角质形成细胞生长因子(KGF)、Vγ5TCR、白细胞介素15(IL-15)、IL-1β、IL-23、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)、组织相容性抗原60(H60)、小鼠UL16结合蛋白样转录子1(Mult1)、维甲酸早期诱导蛋白1(Rae1)的mRNA表达。结果注射后1周,Vγ4T细胞清除组小鼠真皮细胞、淋巴结细胞中Vγ4T细胞比例均明显低于对照组(t值分别为27.99、13.12,P<0.05);Vγ4T细胞清除组和对照组小鼠皮肤大体情况和组织结构无明显区别,表皮组织厚度相近(P>0.05);Vγ4T细胞清除组小鼠表皮细胞中DETC比例为(3.9±0.8)%,明显高于对照组的(1.6±0.5)%(t=4.84,P<0.05)。与对照+5次UVR组相比,Vγ4T细胞清除+5次UVR组小鼠进行1次UVR后皮肤鳞屑增多,照射2次出现鳞屑样痂皮,照射3~5次鳞屑样痂皮明显增多。行UVR后即刻,Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织厚度较对照+1次UVR组明显增加(t=11.50,P<0.05)。与单纯对照组相比,单纯Vγ4T细胞清除组小鼠表皮组织中Vγ5TCR的mRNA表达明显上调(t=41.16,P<0.05),IL-23的mRNA表达明显下调(t=6.52,P<0.05);与单纯对照组相比,对照+1次UVR组小鼠表皮组织中Vγ5TCR、KGF的mRNA表达均明显上调(t值分别为15.22、13.22,P<0.05),IGF-Ⅰ、IL-23的mRNA表达均明显下调(t值分别为3.71、4.95,P<0.05);与单纯Vγ4T细胞清除组相比,Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中IGF-Ⅰ、KGF的mRNA表达均明显上调(t值分别为11.40、18.88,P<0.05),IL-1β的mRNA表达明显下调(t=4.42,P<0.05);与对照+1次UVR组相比,Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中Vγ5TCR、IGF-Ⅰ、KGF的mRNA表达均明显上调(t值分别为4.52、15.24、9.43,P<0.05);4组小鼠表皮组织中IL-15的mRNA表达总体相近(P>0.05)。与单纯对照组相比,单纯Vγ4T细胞清除组表皮组织中NKG2D、Rae1的mRNA表达均明显上调(t值分别为3.67、47.40,P<0.05),对照+1次UVR组小鼠表皮组织中NKG2D、Mult1、Rae1的mRNA表达均明显上调(t值分别为5.30、6.50、9.16,P<0.05);与单纯Vγ4T细胞清除组相比,Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中NKG2D、H60、Mult1、Rae1的mRNA表达均明显下调(t值分别为4.57、4.13、4.67、27.36,P<0.05);与对照+1次UVR组相比,Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中NKG2D、H60、Mult1、Rae1的mRNA表达均明显下调(t值分别为5.77、8.18、12.90、8.08,P<0.05)。结论清除Vγ4T细胞有利于DETC增殖和毒性下调,可能促进UVR后小鼠表皮损伤修复。