1-甲基海因对慢性疼痛大鼠钠离子通道蛋白Nav1.8的干预作用

旨在研究1-甲基海因(1-methylhydantoin,MH)对钠离子通道(Nav channels,Navs)1.8的干预作用,为临床科学治疗疼痛提供理论依据,为实现“疼痛最小化”终极目标拓宽途径。选取60只SPF级SD大鼠通过随机分组设计,各组分别使用1-甲基海因(MH组)、利多卡因(L组)、氨溴索(A组)处理,第21和28天使用蛋白免疫印记法检测大鼠L4~L6段背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)Nav1.8的蛋白表达,采用全细胞膜片钳技术检测MH作用下的Nav1.8通道峰电流。结果表明,与M组相比,MH能使Nav1.8表达显著下降(P<0.05)。MH对Nav1.8通道峰电流具有一定抑制作用,10和100μmol·L^(-1)MH对Nav1.8的电流抑制率分别为6.34%±3.13%和14.6%±1.52%,具有量效关系。提示MH能够下调慢性疼痛大鼠DRG中Nav1.8的表达,同时抑制Nav1.8电流,进而产生镇痛作用。

A型肉毒毒素调控钠离子通道Nav1.8缓解神经病理性疼痛的作用

【目的】研究A型肉毒毒素(Bo NT/A)对腰5脊神经前根切断(L5 VRT)介导的神经病理性疼痛的影响,并进一步探讨其可能的内在作用机制。【方法】利用行为学测试方法观察Bo NT/A足底注射后对L5 VRT大鼠机械刺激撤足阈值的影响,采用Western blot方法分析Bo NT/A对L5 VRT术后背根神经节(DRG)神经元中钠离子通道(Nav1.8)蛋白表达的影响,并进一步应用全细胞膜片钳技术观察Bo NT/A对DRG神经元中功能性Nav1.8电流密度的影响。【结果】一侧足底注射7、15 U/kg的Bo NT/A 1 d后可显著缓解L5 VRT介导的机械触诱发痛症状,且作用时间至少持续至给药后14 d;Bo NT/A可显著下调L5 VRT术后DRG神经元中Nav1.8蛋白表达水平,并可明显降低功能性Nav1.8电流密度。【结论】Bo NT/A可能通过下调DRG神经元中Nav1.8蛋白表达,降低功能性Nav1.8电流,发挥缓解神经病理性疼痛的作用。

Nav1.7和Nav1.8选择性抑制剂对急性术后疼痛的镇痛效力

目的:评估钠通道Nav1.7及Nav1.8选择性抑制剂对急性炎性痛和术后疼痛的影响。方法:实验一:将健康小鼠(C57BL/6J)采用随机数字表法分为溶媒组(Vehicle)、Nav1.7抑制剂给药组(PF-05089771、GDC-0276、GX-201、Ds-1971a)和Nav1.8抑制剂给药组(VX-150、VX-548),行为学检测机械和热痛基础阈值以及福尔马林诱导的疼痛反应。实验二:构建足底切口损伤术后疼痛模型,将造模小鼠采用随机数字表法分为Vehicle组、Nav1.7抑制剂给药组(PF-05089771、GDC-0276)和Nav1.8抑制剂给药组(VX-150和VX-548),行为学检测切口损伤引起的机械和热痛过敏。另取造模小鼠的同侧L_3~L_5背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)组织,通过RNA-Seq、q PCR、WB、IF等方法检测Nav1.7和Nav1.8在术后疼痛模型中的表达变化。结果:Nav1.7选择性抑制剂PF-05089771和Nav1.8选择性抑制剂VX-548对基础痛阈、福尔马林所致炎性痛及足底切口损伤所致的痛觉过敏有缓解作用;造模同侧DRG组织Nav1.7和Nav1.8表达水平不变,但Nav1.8阳性大直径DRG神经元比例增加。结论:Nav1.7和Nav1.8选择性抑制剂对急性术后疼痛具有显著镇痛效力,Nav1.8在NF200阳性中大神经元的分布增加可能参与切口损伤所致痛觉敏化的发生。

电压门控性钠离子通道Nav1.7与疼痛的研究进展

电压门控性钠通道在疼痛的产生和发展中具有关键性作用。而编码Nav1.7的基因突变可能导致一系列遗传性疼痛相关疾病,提示其在疼痛产生机制中的独特作用,可能成为疼痛治疗新的药物靶点。

中药常用止疼药蜈蚣、三七和川芎的NaV1.7离子通道抑制作用比较

目的研究常用的中药止疼药蜈蚣、三七和川芎对NaV1.7离子通道的抑制作用(疼痛的抑制)和NaV1.5离子通道的影响(心脏安全性进行评估)。方法采用超蒸水和95%的乙醇对药物进行提取。NaV1.7离子通道,NaV1.5离子通道和hERG离子通道分别在HEK293细胞中稳定表达,然后使用全细胞膜片钳技术,研究药物分别对这些通道的作用。同时,采用动物行为学实验测试了药物的镇痛作用。结果在本研究中,蜈蚣的水提取物(50μg/ml)、三七的水提取物(150μg/ml)、川芎的水提取物(250μg/ml)对NaV1.7离子通道的抑制作用分别为(22.65±2.78)%、(4.52±0.02)%和(15.49±1.95)%;川芎醇提取物、三七醇提取物、蜈蚣的醇提取物(50μg/ml)对NaV1.7离子通道抑制作用分别为(38.35±5.15)%、(39.80±17.52)%和(91.67±4.16)%。NaV1.7离子通道和NaV1.5离子通道的蜈蚣乙醇提取物抑制作用呈剂量依赖性,NaV1.7和NaV1.5离子通道抑制的IC50值分别为(0.30±0.09)μg/ml和(0.27±0.02)μg/ml。此外,蜈蚣乙醇提取物对hERG通道的抑制作用较弱,IC50值为(16.47±6.96)μg/ml。在动物行为实验中,蜈蚣的水提取物(15 mg/ml)与曲马多显示出相似的镇痛作用。结论通过膜片钳技术和行为学实验发现:这三种中药止痛成份易溶于乙醇,不易溶解于水;蜈蚣醇提取物在这些药物提取物中对抑制疼痛效果最好。但是当使用蜈蚣药酒时,应注意其心脏安全性的影响。

电压-门控钠离子通道Nav1.5与肿瘤关系研究进展

Nav1.5钠离子通道是电压-门控钠离子通道的一种,研究发现Nav1.5不仅在维持正常电生理活动中扮演着重要的角色,而且其多种变构体的表达被认为是和肿瘤形成有密切关系的胚胎基因的再表达。最近的研究证明Nav1.5在人体许多肿瘤组织中的表达水平显著升高,如人脑胶质瘤、乳腺癌等。深入研究发现其在各种肿瘤细胞的增殖和迁移等过程起着重要的作用。本文将结合国内外对电压-门控Na+通道Nav1.5的最新研究进展及本小组的工作,对Nav1.5及其与相关肿瘤的关系作一综述。

钠离子通道NaV1.7与神经病理性疼痛

钠通道NaV1.7是电压门控性钠通道的亚型之一。大多数钠离子通道NaV1.7表达在背根神经节(DRG)小C纤维的伤害性感受器上,具有缓慢开放和缓慢关闭失活的特点。它能够产生大量的斜坡电流,降低感觉神经元中动作电位产生的阈值,放大外来小的缓慢的去极化斜坡电流,从而增加神经元兴奋性,对疼痛的产生、传递、调节具有关键性作用。随着遗传学研究的不断深入,钠离子通道NaV1.7的功能获得性突变和功能缺失性突变,使其成为了新型镇痛疗法中一个的特别有吸引力的药物靶点,受到人们的广泛关注。而研究发现,NaV1.7通道在不同因素引起的神经病理性疼痛中通过不同途径提高神经元兴奋性,参与神经病理性疼痛,给NaV1.7选择性抑制剂研发带来了巨大阻碍。目前,虽然已有的NaV1.7选择性抑制剂具备有效镇痛作用,且无明显副作用或成瘾问题,但寻找NaV1.7选择性配体极其困难。此外,现有的NaV1.7选择性抑制剂也因神经病理性疼痛类型的不同在抑制效力、靶向性、安全性以及可行性等方面存在差异。提示寻找NaV1.7通道作用于不同神经病理性疼痛的普遍机制或NaV1.7通道特有的受体结合位点,可能是未来NaV1.7选择性抑制剂研发的主要方向。本文就NaV1.7通道在不同因素引起的神经病理性疼痛中的主要作用进行简要综述。

钠离子通道1.8参与调控大鼠颞下颌关节炎性痛及其性别差异

通过观察实验性颞下颌关节炎症是否影响大鼠三叉神经节钠离子通道1.8(Nav1.8)mRNA的表达及其在雌、雄大鼠的表达有否差异,即探讨钠离子通道是否参与调控颞下颌关节炎性痛及其性别差异。通过注射完全弗氏佐剂于SD大鼠颞下颌关节上腔建立颞下颌关节炎症模型。采用组织病理学手段确认关节炎症。通过测量摆头阈值及2 h进食量评估大鼠疼痛行为的改变。采用实时荧光定量PCR方法评估三叉神经节Nav1.8 mRNA变化。结果显示,诱导颞下颌关节炎症24h后,滑膜组织出现增生、炎细胞浸润及血管增生等滑膜炎特征。摆头阈值及2 h进食量明显降低,且雌性摆头阈值及2 h进食量低于雄性。同时三叉神经节Nav1.8 mRNA出现上调,且雌性Nav1.8 mRNA上调幅度高于雄性。这些结果提示,三叉神经节Nav1.8可能参与调控颞下颌关节炎性痛以及其性别差异,为进一步理解颞下颌关节紊乱病相关疼痛及其性别差异提供实验依据。

Nav1.8通道在部分神经损伤大鼠背根神经节及外周神经的表达

目的分析Nav1.8通道在坐骨神经部分神经损伤(SNI)大鼠背根神经节(DRG)及外周神经的表达。方法将24只SD大鼠随机分为SNI组及假手术组。SNI组建立SNI模型,假手术组仅暴露坐骨神经及其分支,荧光金逆行标记DRG腓肠神经元胞体。术前和术后第7、14天测定大鼠腓肠神经支配区域机械刺激伤害感受阈值(MWT)。术后第14天,采用免疫荧光染色检测大鼠DRG及外周神经中Nav1.8阳性的神经纤维密度。结果术后7d及14d,SNI组的MWT均低于术前1d的数值及假手术组(均P<0.05),而假手术组各时间点MWT比较差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较,SNI组大鼠DRG荧光金阳性区域和荧光金阴性区域、腓肠神经、胫神经、腓总神经及腓肠神经支配皮肤区域中Nav1.8阳性的神经纤维密度均增高,胫神经支配皮肤区域中的密度降低(P<0.05)。结论Nav1.8通道在DRG未受损神经元区域、未受损神经及支配皮肤区域中表达增高,这可能是SNI大鼠神经病理性疼痛发生的重要机制。

电压门控钠离子通道亚型Nav1.4突变体R1135H对通道功能的影响研究

探讨电压门控钠离子通道亚型Nav1.4突变体R1135H对通道功能的影响研究。方法 利用膜片钳技术对电压门控钠离子通道亚型Nav1.4突变体R1135H对通道动力学功能的影响研究。结果 电压门控钠离子通道亚型Nav1.4突变体R1135H对通道的稳态激活和稳态失活有不同程度的影响。结论 电压门控钠离子通道亚型Nav1.4突变体R1135H对通道功能有明显的影响。

电压门控钠离子通道表达对宫颈癌细胞增殖侵袭转移作用的研究

目的:探讨电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channels,VGSCs)在宫颈癌细胞中的表达、分布及其对该细胞增殖、侵袭能力的影响。方法:用Western blot了解VGSCs在不同宫颈癌细胞株中表达水平,采用免疫荧光检测VGSCs蛋白在细胞中的定位。分别用MTT法和Matrigel法检测VGSCs对宫颈癌细胞的增生和侵袭作用。以半定量RT-PCR和RNAi方法确认宫颈癌细胞中VGSC表达亚型及其功能。结果:在检测的4种宫颈癌细胞株中,ME180细胞表达较高水平VGSCs蛋白,其存在于细胞膜和细胞质中。VGSCs抑制剂-河豚毒素(TTX)对ME180细胞增生无影响(P>0.05),但呈浓度依赖性抑制细胞的Matrigel侵袭(P<0.05)。在ME180细胞中检测到Nav 1.2、Nav 1.6和Nav 1.7三种VGSCs亚型,其中Nav 1.6 mRNA占总mRNA的78%,RNAi抑制Nav 1.6mRNA表达后可降低细胞侵袭达52%(P<0.05)。结论:VCSCs在宫颈癌ME180细胞株高表达,Nav 1.6为其主要表达亚型,增加了体外癌细胞的侵袭转移。

大鼠骨癌痛模型的制备及电压依赖性钠通道Nav1.8在其背根神经节的表达研究

目的建立大鼠骨癌痛模型并观察电压依赖性钠通道Nav1.8在其背根神经节(DRG)的表达,以探讨Nav1.8在癌症性疼痛中的作用。方法在雌性SD大鼠左胫骨内注射Walker256细胞(103/μl、104/μl、105/μl)后1、3、5、7、10、14天观察机械痛敏阈值和CO2激光热痛敏阈值的变化,与对照组大鼠进行比较,分析癌痛组大鼠出现痛阈降低的时间。于接种细胞后14天取双侧胫骨做病理切片观察肿瘤生长情况。RT-PCR检测癌痛组及对照组大鼠L5～L6DRGNav1.8基因的表达。结果所有接种Walker256细胞的大鼠均可见胫骨内实质性肿瘤的膨胀性生长和严重的骨质重构。各癌痛组大鼠分别于第7～14天出现进行性加重的疼痛行为学改变,其左侧(癌痛侧)DRGNav1.8的表达明显升高(P<0.05),对侧的表达与对照组之间无明显差异。结论胫骨内注射Walker256细胞的大鼠在产生浸润性生长的骨肿瘤同时,可伴进行性的痛觉过敏,是骨转移瘤相关疼痛研究可靠的动物模型。Nav1.8基因在骨癌痛模型大鼠DRG中的表达水平上调,提示该通道可能参与骨癌痛的发生过程。

骨癌痛大鼠钠通道Nav1.8的表达与行为学变化

目的观察钠通道Nav1.8在Walker256乳腺癌细胞所致胫骨骨癌痛大鼠背根神经节(DRG)及丘脑中的表达变化,探讨Nav1.8与癌痛的相关性。方法将Wistar大鼠随机分为癌痛组(n=15)和假手术组(n=15)。在癌痛组大鼠胫骨内注入密度为107/m L的Walker256乳腺癌细胞,建立骨癌痛模型;假手术组在大鼠胫骨内注入相同体积的生理盐水。术后8、11、14、17、21 d评估机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。造模21d进行影像学检查后,取其DRG及丘脑组织,荧光实时定量RT-PCR观察Nav1.8 mRNA在DRG和丘脑中的表达变化,免疫荧光观察Nav1.8蛋白在DRG中的表达。结果癌痛组大鼠术后各时间点出现了明显的机械性痛觉过敏,机械性缩足阈值与术前和假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05);术后癌痛组热刺激缩足反射潜伏期无显著变化,与术前及假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Nav1.8 mRNA在手术侧DRG及手术对侧丘脑中的表达明显上调(P<0.05);手术对侧DRG和同侧丘脑中的Nav1.8 mRNA与假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Nav1.8的表达上调与大鼠骨癌痛的发生有一定关系。

Na_v 1.7与L-型钙离子通道在宫颈癌中的表达及临床意义

目的:探讨钙离子通道1.7亚型(Na_v1.7)与L-型钙离子通道在子宫颈癌中的表达及临床意义。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测60例宫颈癌组织、10例经放化疗前后的宫颈癌组织、10例正常宫颈组织中的Na_v1.7与L-型钙离子通道的表达。结果:Na_v1.7在宫颈癌中平均值为1.640 3,在正常宫颈组织中不表达,两者相比有显著性差异(P<0.01)。Na_v1.7 mRNA在高分化癌、中分化癌及低分化癌中的表达分别为0.960 1、0.991 8及1.901 4,低分化组Na_v1.7 mRNA表达高于高、中分化组,差异有统计学意义(P<0.05)。Na_v1.7 mRNA在宫颈癌Ⅰ-Ⅱ期的表达为0.986 7,在宫颈癌Ⅲ-Ⅳ期中的表达为1.899 3,差异有统计学意义(P<0.05),Na_v1.7 mRNA在放化疗前的宫颈癌组织中表达为1.401 0与放化疗后的0.300 1相比,有显著性差异(P<0.01)。L-型钙离子通道α21C亚单位mRNA(L-Ca+α_1C mRNA)在正常宫颈组织中与宫颈癌组织中的灰度值的平均值为0.091 4及0.357 3,差异有统计学意义(P<0.05)。LCa^(2+)α_1C mRNA在高分化癌、中分化癌及低分化癌中的表达分别为0.291 2、0.304 3及0.493 5,差异有统计学意义(P<0.05)。L-Ca^(2+)α_1C mRNA在宫颈癌Ⅰ-Ⅱ期中的表达为0.475 4,在宫颈癌Ⅲ-Ⅳ期中的表达为0.833 7,差异有统计学意义(P<0.01)。L-Ca2+α_1C mRNA在放化疗前的宫颈癌组织中的表达为0.531 6与放化疗后的0.102 4相比,有显著性差异(P<0.01)。结论:Na_v1.7与L-型钙离子通道在宫颈癌中高表达,与宫颈癌的不良预后有关。放化疗可降低Na_v1.7与L-型钙离子通道基因的表达,与疗效相关。

康泰胶囊对大鼠DRG神经元上电压门控性钠通道Nav1.8受体的影响

目的观察康泰胶囊对IBS内脏高敏感性大鼠结肠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元Nav1.8通道受体的影响,探讨康泰胶囊治疗IBS的作用机制。方法采用慢性不可预计应激法建立内脏高敏感性IBS大鼠模型,应用腹部回缩反射(AWR)、尿D-木糖排泄实验、焦虑行为测试及血清皮质醇水平对模型内脏敏感程度进行评估,采用实时荧光定量PCR方法检测大鼠DRG神经元上Nav1.8通道受体mRNA表达水平,观察康泰胶囊对内脏高敏感IBS大鼠DRG神经元上Nav1.8通道受体mRNA表达水平的影响。结果康泰胶囊可以明显降低模型大鼠AWR评分(P<0.01),明显升高模型大鼠尿D-木糖排泄率(P<0.05),增加模型大鼠进入开臂次数和开臂滞留时间百分比(P<0.01),显著降低血清皮质醇水平(P<0.01),明显降低大鼠DRG神经元上Nav1.8通道受体mRNA表达水平(P<0.01)。结论康泰胶囊能抑制应激引起的内脏高敏感IBS大鼠DRG神经元上的Nav1.8通道受体表达,从而降低结肠背根神经元兴奋性,是其治疗IBS的作用机制之一。

钠离子通道Na_v1.7在大鼠牙髓炎中的表达

目的通过检测大鼠实验性牙髓炎牙髓中电压门控钠离子通道Nav1.7的表达,探讨Nav1.7的表达与牙痛的关系。方法大鼠切牙髓腔暴露,置入脂多糖(LPS)诱导产生牙髓炎。大鼠分为正常对照组和封LPS 1、3、5 d组,HE染色观察各组牙髓组织病理学改变。通过免疫组化、ELISA和逆转录PCR(RT-PCR)方法检测大鼠正常牙髓和炎症牙髓中Nav1.7的表达。结果封LPS 1 d组,牙髓中未见明显炎症,而封LPS 3和5 d组牙髓中炎症反应程度逐渐上升。免疫组化结果显示,Nav1.7在所有牙髓中均有表达,封LPS 3和5 d组牙髓中Nav1.7表达量较正常对照组明显增加(P<0.05);ELISA结果与上述结果相似。RT-PCR结果显示,封LPS 3和5 d组牙髓中Nav1.7 mRNA较正常对照组有显著上调(P<0.05)。结论在牙髓炎中,Nav1.7可能以时序控制方式表达明显增多,且与牙髓炎炎症程度相关。鉴于Nav1.7在疼痛中发挥了重要作用,牙髓中Nav1.7的表达可能涉及牙痛的病理生理机制。

脊髓背角神经元上调Nav1.8通道参与缺血再灌注损伤后痛觉过敏的机制

目的观察鞘内注射钠通道抑制剂619C89对脊髓缺血再灌注损伤引起的痛觉过敏大鼠的痛阈、脊髓背角神经元中Nav1.8通道表达的影响。方法 SD大鼠随机分为3组：假手术组（S组）、痛觉过敏组（H组,缺血再灌注前3 d鞘内注射30μL生理盐水）、钠通道抑制剂组（I组,缺血再灌注前3 d鞘内注射619C895μg/30μL）。S组仅暴露主动脉弓而不结扎,其他各组开胸后无创动脉夹夹闭主动脉弓14 min后再开放,建立SCIRI引起的痛觉过敏模型。各组手术前均于L_（5-6）鞘内置管并连续注射3 d。术后1、3、5、7、14 d分别测定各组大鼠的热痛阈及机械性痛阈;取第4~6节腰段脊髓,采用免疫双荧光法观察背角神经元状态及其Nav1.8的表达,Real time-PCR法检测各组大鼠脊髓组织Nav1.8表达。结果与S组相比,术后各观察点（尤以第7天为著）H组大鼠热痛阈和机械性痛阈降低,损伤后7 d脊髓组织中Nav1.8 mRNA的表达增加（P〈0.05）;I组大鼠热痛阈和机械性痛阈值明显提高（P〈0.05）,脊髓组织中Nav1.8 mRNA的表达降低（P〈0.05）。免疫双荧光染色显示,损伤后7 d,H组大鼠脊髓背角Nav1.8的荧光强度明显增加,且主要表达在NeuN表达阳性的神经元的胞浆中;且与S组相比,H组中NeuN/Nav1.8双阳性的细胞数量明显增多,而I组双阳性的细胞数量减少（P〈0.05）。结论脊髓背角神经元通过上调Nav1.8通道参与缺血再灌注损伤后痛觉过敏的形成。

兔抗鼠钠通道Nav1.8多克隆抗血清的制备

目的制备高效价的兔抗鼠钠通道Nav1.8多克隆抗血清。方法合成鼠Nav1.8钠通道C末端短肽;用该短肽免疫兔获得抗血清;利用硫酸铵盐析法对抗血清进行纯化获得粗提的抗体;琼脂糖凝胶双扩实验测定抗体效价。结果经免疫得到了兔抗鼠Nav1.8多克隆抗血清;免疫组化表明兔抗鼠钠通道Nav1.8多克隆抗血清在三叉神经痛患者患支神经中有表达。结论兔抗鼠钠通道Nav1.8多克隆抗血清可用以代替人类抗Nav1.8多克隆抗血清用于三叉神经痛的检测。

SiRNA抑制大鼠背根神经节神经元电压依赖型钠通道Nav1.8表达的实验研究

目的应用小片段干扰RNA(SiRNA)转染原代培养背根神经节(DRG)神经元,观察SiRNA干扰DRG神经元基因Nav1.8表达的有效性。方法根据RNA干扰的原理及SiRNA的设计原则,设计2个长度为21bp的以Nav1.8基因为靶点的SiRNA(SiRNAa和SiRNAb),另选择相同长度的无义双链RNA作为阴性对照RNA。T7RNA聚合酶的作用下体外转录合成SiRNA,阳离子脂质体转染试剂将SiRNA导入体外培养DRG神经元,于转染后48h提取RNA,采用RT-PCR和荧光定量PCR检测Nav1.8基因的表达情况。结果在靶向Nav1.8的两个SiRNA序列中,SiRNAa转染神经元后导致Nav1.8基因表达显著降低(48.32±6.84)%,SiRNAb使Nav1.8表达降低(23.32±3.19)%,P均<0.01,阴性对照SiRNA对Nav1.8的表达不产生影响。结论利用体外转录合成的SiRNA成功转染原代培养的DRG神经元,并诱导产生内源性Nav1.8基因的特异性表达抑制。具有较高干扰效应的SiRNA片段可应用于抑制Nav1.8基因表达,进而研究Nav1.8的功能及在疼痛治疗中的作用。