基于Me-MLiverpool重组蛋白的新孢子虫胶体金免疫层析检测方法的建立

根据GenBank公布的Nc-livepoor的基因序列,分析Nc-livepoor免疫蛋白的优势线性抗原表位,依据分析结果选取Nc-Liverpool的优势抗原表位集中片段进行串联,构建合成Me-Nc-MLiverpool基因。将该基因克隆至pET-30a(+)质粒中构建重组蛋白质粒pET-30a-Me-Nc-MLiverpool原核表达载体,再进行IPTG诱导表达、分析和纯化及SDS-PAGE和Western blot验证。以0.75 mg/mL的SPA做金标抗原,用纯化后浓度为1 mg/mL的重组蛋白和牛IgG分别做检测线和质控线,建立了检测新孢子虫抗体的胶体金免疫层析检测方法(CGIA)。重组质粒pET-30a-Me-Nc-MLiverpool双酶切验证结果显示,在636 bp的位置有条带,说明重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白大小为39.32 ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可与新孢子虫阳性血清特异性识别,表明重组蛋白有较强的反应原性;特异性试验结果显示,新孢子虫CGIA与弓形虫、肝片吸虫、包虫阳性血清不发生交叉反应;敏感性分析显示,GICA可检测出的Nc阳性血清最大稀释倍数为1∶512;对92份牛血清样品进行检测,与商品化的新孢子虫ELISA检测试剂盒检测结果一致,表明建立的GICA准确性较高。综上所述,研究建立的基于新孢子虫Nc-livepoor基因胶体金免疫层析检测试纸条具有较高的灵敏性和特异性,可为新孢子虫病的诊断提供技术支撑。