新孢子虫天冬氨酰蛋白酶ASP5功能研究

目的制备抗新孢子虫NcASP5多克隆抗体,对NcASP5蛋白进行亚细胞定位;构建NcASP5基因敲除虫株(△NcASP5),探究NcASP5蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。方法原核表达NcASP5蛋白,纯化后免疫小鼠,制备抗NcASP5蛋白多克隆抗体,免疫荧光法观察NcASP5蛋白亚细胞定位;运用CRISPR-cas9技术构建△NcASP5虫株,通过噬斑试验、入侵试验、增殖试验、逸出试验和动物试验探究NcASP5蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。结果成功制备抗NcASP5蛋白多克隆抗体,免疫荧光法观察NcASP5蛋白定位于虫体细胞质;成功构建△NcASP5虫株,其噬斑面积、入侵率和逸出率与野生虫株比较差异均无统计学意义(均P>0.05),增殖率△NcASP5虫株在含1个与8个速殖子的纳虫空泡的数量所占百分比差异有统计学意义(P<0.05)。与感染野生虫株小鼠相比,感染△NcASP5虫株小鼠死亡时间延长2~4 d,组织中荷虫量差异无统计学意义(P>0.05)。结论敲除NcASP5基因对新孢子虫虫体增殖有显著影响,而对虫体的生长、入侵及毒力等无显著影响,这为揭示新孢子虫致病机制和新孢子虫病防控提供了理论依据。