Ndfip1在帕金森病模型小鼠黑质中的表达变化

目的观察携带人突变型α-突触核蛋白(A53T)的帕金森病(PD)转基因小鼠及1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的PD模型小鼠黑质区Nedd4家族相互作用蛋白1(Ndfip1)的表达变化。方法选取12月龄A53T转基因小鼠和同窝野生型(WT)对照小鼠,采用免疫印迹技术检测小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达变化;选取8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组,MPTP组小鼠连续5 d给予MPTP腹腔注射(30 mg·kg^(-1)·d^(-1)),对照组给予等体积的生理盐水,采用免疫印迹技术检测小鼠黑质区Ndfip1及酪氨酸羟化酶(TH)的蛋白表达变化。结果与WT小鼠相比,A53T转基因小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达降低,差异有统计学意义(t=2.294,P<0.05);与对照组相比,MPTP组小鼠黑质区Ndfip1及TH的蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(t=2.149、9.935,P<0.05)。结论携带人突变型α-突触核蛋白(A53T)的PD转基因小鼠及MPTP诱导的PD模型小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达均下降。

Ndfip1对铁离子诱导的神经细胞凋亡的抑制作用及其神经保护作用机制

目的:观察铁超载条件下跨膜蛋白Nedd4家族反应蛋白1 (Ndfip1)过表达对神经细胞凋亡的抑制作用,探讨Ndfip1对神经细胞的保护作用机制。方法:分别以Ndfip1质粒和空质粒转染的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分为实验组和对照组。在铁离子超载条件下,采用MTT比色法测定2组细胞生存率,采用活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)检测试剂盒检测2组细胞中ROS水平和MDA水平,Western blotting法测定2组细胞中B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (caspase-3)的蛋白表达水平。结果:与对照组比较,实验组细胞生存率明显升高(P<0.05)。实验组细胞内荧光强度明显弱于对照组,即实验组细胞中ROS水平明显低于对照组。与对照组比较,实验组细胞中MDA水平明显降低(P<0.05),细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Bax和caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:Ndfip1可以减轻铁离子超载诱导的神经细胞凋亡,提高细胞生存率,对神经细胞具有保护作用;其作用机制可能与减轻细胞内氧化应激反应和抑制凋亡途径有关。

补中益气汤通过miR-155/Ndfip1/Pten轴调控Th17细胞改善自身免疫性甲状腺炎的作用机制

目的:探讨补中益气汤通过微小RNA-155(miR-155)/Nedd4家族相互作用蛋白1(Ndfip1)/磷酸酯酶与张力蛋白同源物(Pten)轴调控辅助性T细胞17(Th17)改善自身免疫性甲状腺炎(AIT)的作用机制。方法:将100只SPF级8周龄NOD.H-2h4小鼠饲以高碘水(0.05%碘化钠)喂养,8周后制成AIT模型,按随机数字表法分为模型组、补中益气汤低、中、高剂量组(4.78、9.56、19.12 g·kg^(-1))、西药组(硒酵母片3.033×10^(-5) g·kg^(-1)),每组20只,另设20只空白组小鼠,空白组及模型组灌胃等体积蒸馏水。连续给药8周后,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测小鼠甲状腺组织miR-155-5p、Ndfip1、Pten、蛋白质酪氨酸激酶1(Jak1)、信号传导和转录激活因子3(Stat3)、维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)、白细胞介素-17(IL-17)mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠甲状腺组织Ndfip1、Pten、Jak1、Stat3、RORγt、IL-17蛋白的表达;免疫组化法检测小鼠甲状腺组织中Ndfip1、Pten蛋白表达;流式细胞术检测小鼠脾脏Th17细胞比例。结果:与空白组比较,模型组小鼠脾脏Th17细胞比例显著升高(P<0.01),miR-155-5p、Jak1、Stat3、RORγt、IL-17的表达显著升高(P<0.01),Ndfip1、Pten的表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,各给药组小鼠脾脏Th17细胞比例降低(P<0.05,P<0.01),miR-155-5p、Jak1、Stat3、RORγt、IL-17的表达明显减少(P<0.05,P<0.01),Ndfip1、Pten的表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论:补中益气汤可改善AIT小鼠自身免疫失常,其机制可能与通过miR-155调控Ndfip1/Pten轴进而调控Th17细胞分化有关。

Rab11-FIP4通过IGF1R调控结直肠癌细胞迁移和侵袭

目的:探讨Rab11家族相互作用蛋白4(Rab11-FIP4)在结直肠癌发生发展中的作用、临床意义及相关机制。方法:通过免疫组化、Western blot及RT-qPCR比较结直肠癌组织与相应的癌旁组织中、正常环境及缺氧条件下直肠癌细胞中Rab11-FIP4的表达水平;应用免疫组化染色评分将临床病例分为Rab11-FIP4高表达组(n=61)和Rab11-FIP4低表达组(n=39),通过Kaplan-Meier生存分析比较两组的总生存时间与复发时间;构建Rab11-FIP4过表达慢病毒,感染结直肠癌细胞株HCT116和LoVo,采用CCK-8法、集落形成实验和Transwell实验检测Rab11-FIP4过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响。免疫共沉淀实验检测Rab11-FIP4与胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)的相关性;人类磷酸激酶抗体阵列测定探讨Rab11-FIP4高表达的结直肠癌细胞中受IGF1R影响的信号通路;组织微阵列及双萤光素酶报告基因分析Rab11-FIP4与缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的关系。结果:Rab11-FIP4在结直肠癌组织中高表达(P<0.01),且Rab11-FIP4过表达与结直肠癌患者的预后不良有关(P<0.05)。Rab11-FIP4的过表达促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05)。Rab11-FIP4的过表达通过IGF1R调节ERK1/2和AKT信号通路(P<0.05)。缺氧促使Rab11-FIP4启动子上的HIF-1α活化,从而上调Rab11-FIP4的表达(P<0.05)。结论:Rab11-FIP4可能作为促癌基因通过IGF1R调控结直肠癌细胞的迁移和侵袭。

Ndfip1质粒的构建及其在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的表达

目的:观察Nedd4家族反应蛋白1(Ndfip1)过表达条件下神经细胞中二价金属离子转运蛋白1(DMT1)的表达,探讨Ndfip1对DMT1的调控作用。方法:构建Ndfip1真核表达质粒,应用Ndfip1质粒转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,检测转染效率。Ndfip1质粒转染的SH-SY5Y细胞为实验组,空质粒转染的SH-SY5Y细胞为对照组,应用免疫荧光法观察2组细胞中DMT1蛋白表达强度,采用蛋白印迹法定量检测2组细胞DMT1蛋白表达水平。结果: Ndfip1质粒经扩增、电泳分离和测序比对,证明质粒构建成功。Ndfip1质粒转染48 h后,与转染前比较,SH-SY5Y细胞中Ndfip1蛋白表达水平明显增加(P<0.01),证明转染成功。免疫荧光法检测,与对照组比较,实验组细胞中DMT1的荧光强度明显减弱。蛋白印迹法检测,与对照组比较,实验组细胞中DMT1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论: Ndfip1过表达可下调神经细胞中DMT1蛋白的表达,Ndfip1对DMT1具有负性调控作用,通过减少神经细胞中铁离子的蓄积对神经细胞起到保护作用。