HIV-1C亚型调控蛋白Nef在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型调控蛋白Nef,为研制HIV疫苗寻找新的途径。方法通过PCR扩增,获得HIV-1C亚型Nef基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。结果表达产物是相对分子质量为50000的GST融合蛋白,且能与p27单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Nef蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达。

抗Nef蛋白单抗的制备与鉴定及应用——Ⅰ:应用合成Nef蛋白肽分析抗Nef蛋白单抗的特异性

本文报告了应用杂交瘤技术制备出97个鼠抗HIV重组Nef蛋白的单抗,并应用24个按Nef蛋白氨基酸顺序合成的部分重叠的肽(Over lapping peptides)鉴定其肽特异性以及采用“肽扫描”(Pepscan;Pin ELISA)法进一步研究单抗的抗原表位特异性。文中对合成肽在抗原性分析以及抗蛋白单抗的肽特异性和表位特异性鉴定上的应用与优点进行了讨论。

HIV-1及其nef蛋白存在有与正常人组织呈交叉反应的表位

本文报导了从大量抗HIV-1结构蛋白单抗和抗nef肽、nef蛋白单抗中发现的HIV-1及其nef蛋白存在有与正常人组织呈交叉反应的表位。这些单抗的特异性为抗HIV-1 p55+p24;抗gp160+gp120+gp41;抗p18+p27;抗nef蛋白(表位为由LHGM组成的四个氨基酸顺序)及抗nef蛋白肽(表位为由HPE或HPEY组成的氨基酸顺序)。它们与正常人扁桃体中的基质、血管内皮或平滑肌起反应。文中对AIDS病人自身免疫反应性进行了讨论。

重组HIV-1 CN54 Nef抗原的制备及鉴定

目的原核表达HIV-1CN54调控蛋白Nef,并进行纯化、复性及鉴定。方法将CN54 Nef基因克隆至pThio-HisA载体,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21 Codonplus-RIL,IPTG诱导表达,通过尿素梯度洗涤包涵体纯化Nef蛋白,透析复性。Western blot检测目的蛋白的特异性。结果Nef蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上。用尿素洗涤法可直接纯化Nef,纯度达到90%以上。Nef蛋白透析后溶解于PBS缓冲液中。Western blot检测显示了良好的特异性。结论HIV-1 CN54 Nef抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达,采用的纯化和复性Nef蛋白的工艺简便、快捷,为开发针对Nef基因的HIV-1疫苗奠定了基础。

分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建含有人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type Ⅰ,HIV-1)负性调节因子(nega-tive regulation factor,Nef)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况,为进一步研究Nef功能奠定基础。方法:利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因,插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液,蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果:限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实,成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体,该质粒转染293T细胞后,蛋白质印迹法能够检测到Nef-EGFP融合蛋白的表达条带,ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论:成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒,融合蛋白Nef-EGFP在293T细胞中获得表达,并能分泌到胞外。

cAMP依赖蛋白激酶(PKA)磷酸化Nef蛋白对HIV复制的影响

目的:研究Nef PKA磷酸化位点对HIV复制的影响。方法:在全长HIVNL4-3中,通过将Nef Ser9突变为丙氨酸,构建一个单突变HIV DNA。接着用野生型HIV或单突变型HIV产生病毒,然后用病毒去感染外周血单核细胞(PBMC)。结果:与亲代病毒比较,单突变Ser9为丙氨酸的病毒下调了HIV在静息PBMC中的复制。结论 :该突变在消除静息原代细胞中Nef对HIV复制的影响起重要作用。研究结果显示,PKA对Nef磷酸化是静息细胞中病毒生命周期的重要步骤。

HIV-1 B’亚型感染者Nef蛋白CTL表位变异与病毒载量的相关性

目的探讨HIV-1 B’亚型毒株感染者Nef蛋白细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位变异及其与病毒载量的相关性。方法从137例HIV-1 B’亚型毒株感染者的血浆样本中提取病毒RNA,经逆转录及巢式PCR扩增获得Nef基因并测序,将获得的Nef基因序列翻译为蛋白序列,然后与HIV免疫学数据库中经过实验证实的CTL表位进行比对,分析Nef蛋白CTL表位变异与感染者病毒载量的关系。结果与HIV免疫学数据库中CTL表位的比较发现,本研究137例HIV-1 B’亚型毒株感染者病毒Nef蛋白大部分CTL表位相对保守,只有5个表位的变异频率超过10%,CTL表位旁序列的变异程度较锚着位点变异大,表位旁上下游第一位氨基酸的突变频率较高,表位氨基酸总变异频率、锚着位点和表位旁序列的氨基酸变异频率与病毒载量呈正相关,非锚着位点氨基酸的变异与病毒载量无相关性。结论 HIV-1 B’亚型毒株感染者Nef蛋白大部分CTL表位较保守,CTL表位旁序列变异程度较锚着位点大,表位旁上下游第一位氨基酸的突变频率较高,推测表位旁序列氨基酸的变异可能是Nef蛋白CTL逃逸突变的主要方式,Nef蛋白CTL表位变异与病毒适应性损伤的关系还需进一步研究。

HIV-1B'亚型毒株感染者Nef蛋白氨基酸序列变异分析

目的分析HIV-1 B’亚型毒株Nef蛋白重要功能区及CTL表位氨基酸序列变异特征。方法从137例HIV-1感染者的血浆样本中提取病毒RNA,进行逆转录获得c DNA,再经巢式PCR扩增全长Nef基因并纯化测序。利用Bio Edit、Mega6.0软件分析所获得的Nef基因重要功能区的氨基酸变异,并比较所获得的Nef基因共享序列与我国B亚型Nef共享序列及国际B亚型Nef共享序列的CTL表位情况。结果 HIV-1 B’亚型毒株Nef蛋白N端豆蔻酰化信号区、蛋白酶加工区、酸性区、Pak结合区、Pxx P区等功能区氨基酸序列较为保守,但有3个功能区中存在变异率大于30%的氨基酸位点,其中长度可变区的21号密码子上的R被E/K/Q取代的变异率达56.21%(R21E 24.09%,R21K 19.71%,R21Q 12.41%),COPI结合区EE154-155的E154被K取代的变异率为32.85%,双亮氨酸基序Exxx LL160-165的S163被C取代率为30.66%。本研究所得的137条Nef蛋白的共享序列的CTL表位与我国HIV-1 B亚型的共享序列CTL表位一致,而与国际B亚型共享序列相比有两个肽段表位的氨基酸发生了变异。结论 HIV-1 B’亚型毒株Nef蛋白多数重要功能区及CTL表位的氨基酸序列较保守,但有3个功能区存在变异率大于30%的氨基酸位点,这种特性可能影响病毒致病作用。

HAD及非HAD患者中枢神经系统来源的HIV-1 Nef蛋白对U87细胞自噬的影响

目的研究HIV-1 Nef蛋白氨基酸位点变异对其抑制神经细胞自噬的影响,探讨Nef蛋白致中枢神经系统损伤的机制。方法分别扩增和克隆1例HIV相关性痴呆(HIV-associated dementia,HAD)患者(H)及1例非AIDS HAD患者(N)中枢神经系统颞叶(temporal cortex,TC)部位的HIV-1 nef基因,进行序列分析,研究氨基酸位点变异;构建H-TC和N-TC来源的Nef真核表达载体p EGFP-N1-nef,并分别转染U87细胞,观察绿色荧光蛋白并初步判断Nef蛋白表达情况;同时Western blot检测U87细胞Nef蛋白及细胞自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、p62蛋白的表达,分析不同来源的Nef对U87细胞自噬的影响。结果PCR扩增并构建H-TC及N-TC nef基因克隆载体pMD-19T-nef,测序证实为HIV-1B亚型,氨基酸序列分析显示,H-TC与N-TC关键氨基酸位点存在差异;成功构建pEGFP-N1-nef重组质粒,在U87细胞内表达Nef蛋白,转染后48 h Nef蛋白表达量最高;Western blot结果分析表明,LC3-Ⅱ蛋白的表达量在组间的差异有统计学意义(F=11.764,P=0.001),两组细胞中LC3-Ⅱ含量较低,Western blot未能检测到。,空白组与空载体组之间LC3-Ⅱ的表达量差异无统计学意义(P=0.169),H-TC、N-TC及阳性对照CQ组LC3-Ⅱ表达升高,与空白对照或空载体相比,差异具有统计学意义(P=0.017,P=0.039,P=0.031),且H-TC组LC3-Ⅱ的表达量高于N-TC组(P=0.023);H-TC、N-TC及阳性对照CQ组p62蛋白的表达量较空白对照或空载体组有所升高,但组间差异无统计学意义(F=2.049,P=0.163)。结论HAD及非HAD患者中枢神经系统中HIV-1 Nef氨基酸位点存在差异,对U87细胞自噬的影响也因此不同,H-TC来源的Nef诱导自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达的能力更强。

Nef蛋白与HIV-1的潜伏感染

1型艾滋病病毒(HIV-1)感染可引起严重的全身免疫系统损害最终导致患者死亡。抗病毒治疗(ART)可有效抑制病毒复制,从而提高HIV-1感染者的存活率,但长期ART并不能清除HIV-1潜伏库。一旦停止抗病毒治疗,病毒再度复制将不可避免地发生。作为HIV-1表达的早期蛋白之一,Nef可经多种途径调节宿主细胞的功能状态及病毒自身复制状况,从而可能影响HIV-1的潜伏感染。本文就Nef蛋白影响HIV-1潜伏感染的可能机制和途径做一综述,为HIV-1防治提供新的思路和线索。

HIV-1 Nef蛋白神经毒性研究进展

HIV-1是获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的病原体,可侵犯中枢神经系统(central nervous system, CNS),引起一系列神经系统病变,如HIV相关神经认知障碍(HIV-associated neurocognitive disorder,HAND)。Nef(negative factor)蛋白是HIV-1病毒早期蛋白之一,在HIV-1神经致病性中具有重要作用。本文从Nef对血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性的影响、对神经元的直接及间接损伤作用3个方面综述了Nef的神经毒性及其机制。

人体细胞膜跨膜蛋白丝氨酸整合因子3和5的抗艾滋病毒作用

艾滋病病毒(HIV-1)中的Nef蛋白具有重要的维持患者病毒高载量、加快疾病进展、下调CD_4、主要组织相容性复合物(MHC)等多种分子,增强病毒的复制能力和感染性等多种功能。然而,20多年来,Nef蛋白增加病毒感染性的机制并不清楚。最近的进展表明,人体细胞膜跨膜蛋白丝氨酸整合因子3和5(serine incorporator 3,SERINC3 and SERINC5)具有重要的抗病毒作用,而HIV-1编码Nef蛋白拮抗这一作用。