大鼠nelin基因干扰质粒的构建及其体外抑制效果研究

目的构建大鼠nelin基因干扰质粒并对其进行体外抑制效果验证,为研究nelin在心脏发育、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供有效的研究工具。方法提取大鼠心肌组织RNA,逆转录为cDNA,设计合成含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以大鼠cDNA为模板PCR扩增获得nelin基因,定向克隆入pEGFP-N1-3FLAG载体,测序验证。以克隆得到的大鼠nelin基因为模板,设计合成候选干扰序列,亚克隆至pGCSIL-U6载体,获得干扰质粒。以nelin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染HEK293T细胞,WesternBlot方法检测干扰效果。结果成功克隆了大鼠nelin基因并构建了nelin基因重组表达载体pEGFP-N1-3FLAG-rNelin。设计构建的4个干扰质粒(靶位点分别为+370-388位,+376-394位,+545-563位,+1206-1224,命名为pGCSIL-U6-nelin/siteⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)均可显著降低nelin基因的表达,尤以靶向(+370-388位)位点即pGCSIL-U6/nelin-siteI质粒的干扰效果最佳。结论本实验构建的大鼠nelin基因特异性干扰质粒能从蛋白水平上高效特异地抑制ne-lin基因表达,为进一步开展其功能研究奠定了基础。

延边地区健康人群Nelin基因单核苷酸多态性研究

目的分析延边地区健康人群Nelin基因单核苷酸多态性(SNP)的分布特征。方法采用DNA序列测定技术,检测114例延边地区健康人Nelin基因外显子及外显子/内含子连接区的核苷酸序列。利用核酸序列分析软件与Genbank的Nelin基因序列比对,对SNP位点进行序列分析。结果通过对4个外显子SNP位点的序列分析,共发现2个SNP位点。其中1个为NCBI数据库中报道的rs1166698位点,新发现1个位点,NCBI数据库中报道的本研究人群中没有发现的位点3个。rs1166698位点为第8外显子区G/A错义突变(48364365 G/A),其基因型频率为GG:31.6%,GA:52.6%,AA:15.8%,等位基因频率为G:57.9%,A:42.1%。通过对延边地区人群该位点的民族、性别比对分析,基因型、等位基因频率在朝汉族、男女间的分布无明显差异。新发现的位点是第9外显子区A/G错义突变(1195 A/G),基因型AA占88.6%(101/114),AG占11.4%(13/114),未发现突变纯合子GG基因型。结论通过本研究了解了延边地区Nelin基因相关SNP位点遗传分布特征,为研究Nelin基因多态性与疾病的关系奠定了基础。

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin的原核表达与分离纯化

目的:原核表达并分离纯化人细胞骨架调节蛋白基因Nelin。方法:利用DNAstar软件预测Nelin的B细胞表位,选择Nelin基因B细胞表位较多、特异性最强的片段。用DNA重组技术,将此片段插入原核表达载体pET28a(+),构建C末端带有His6标签的原核表达载体pET28a-Nelin,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,产物用Ni2+金属螯合吸附层析柱纯化。结果:成功构建了pET28a-Nelin表达载体,IPTG诱导后表达分子量约为17000的可溶性蛋白,Nelin-His6蛋白的表达量占菌体总蛋白的18%,经Ni2+金属螯合层析柱纯化,得到了电泳纯的Nelin-His6蛋白。结论:建立了稳定的Nelin基因的表达体系,为其功能研究奠定了基础。

Nelin基因在下肢静脉曲张患者的表达研究

目的研究Nelin基因在下肢静脉曲张患者的表达。方法选取2016年1月至2017年6月该院收治的25例下肢静脉曲张患者作为研究组,选取同期大隐静脉正常行外科手术的25例患者作为对照组。采集两组患者外周静脉血采用免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法检测Nelin基因表达。结果研究组患者Nelin基因蛋白表达强度明显弱于对照组,血清Nelin蛋白含量、血清Nelin蛋白构成比例均明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论下肢静脉曲张患者存在Nelin基因蛋白下调或缺失现象,提示下肢静脉曲张可能与Nelin基因有关。

新基因nelin在下肢曲张静脉中的表达及其意义

目的:从基因的转录和翻译水平探讨nelin在下肢曲张静脉中的表达及意义。方法:分别利用RT-PCR技术以及免疫组织化学技术比较静脉曲张患者(实验组)以及正常人(对照组)之间大隐静脉血管组织中nelin基因及其蛋白的表达水平。结果:实验组的病变静脉组织中,nelin的表达低于对照组。RT-PCR显示,实验组与对照组目的条带亮度不同,对照组较实验组亮;免疫组织化学显示,对照组中nelin蛋白大量分布于正常静脉管壁血管平滑肌细胞的胞质,呈棕黄色,平均阳性细胞百分比为(80.67±10.20)%;而实验组中染色较弱,呈浅黄色,平均阳性细胞百分比为(18.39±7.78)%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:与正常人相比,原发性下肢静脉曲张患者的病变静脉组织中nelin基因在转录和翻译水平均存在明显的表达下调,这可能与病变静脉组织的形态学改变有一定的关系。

RhoA/SRF信号通路介导Nelin诱导人血管平滑肌细胞表型转化

目的 探讨Nelin基因对人血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）表型转化的调控机制.方法 应用过表达慢病毒载体[Nelin-VSMC]及干扰慢病毒载体[LV-Nelin-SiRNA-VSMC]制备稳定转染的VSMC细胞模型,通过荧光定量PCR以及蛋白质印迹分析（Western blotanalysis,WB）等技术手段,观察Nelin蛋白过表达及表达抑制对人VSMC表型转化的影响及其调控机制.结果 Nelin-VSMC组细胞呈收缩表型,细胞细长,成“谷-峰”样生长,Nelin mRNA、Nelin蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白（SMoα-actin）表达显著增加,同时SMα-actin相关调控因子-血清反应因子（SRF）入核转位,RhoA总蛋白表达上调,经Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后,SRF在细胞核中表达显著减少,同时SMα-actin表达下调;LV-Nelin-SiRNA-VSMC组细胞呈合成表型,细胞体积变大,细胞极性消失,生长状态无序,Nelin mRNA、Nelin蛋白和SMα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调.结论 在体外培养的人VSMC中,Nelin依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF引起SMα-actin表达增加,促进VSMC向收缩表型转换.