通过胚胎干细胞途径获得的嵌合体小鼠中neo基因在各组织中的分布

为探讨小鼠胚胎干细胞参与早期胚胎发育的潜能 ,以neo基因作为目的基因进行了胚胎干细胞的转染 ,经G41 8的筛选 ,获得表达neo基因的单克隆细胞 ,挑取部分克隆扩大 ,进行小鼠囊胚腔注射 ,再重新植入小鼠子宫 ,共注射了 60个囊胚 ,分别回输到 5只假孕小鼠 ,在子代中得到了携带有neo基因的嵌合体小鼠。通过对嵌合体小鼠各组织PCR分析发现 ,neo基因可以在皮肤、肝脏。

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。

转基因猪中抗生素标记基因neo漂移风险评估

本试验旨在研究转基因猪中抗生素标记基因neo漂移的可能性。利用Southern blotting鉴定F1代仔猪的显隐性,结果发现6头仔猪中有3头为转基因仔猪,3头为阴性仔猪。通过PCR技术对试验仔猪血液和消化道组织中neo基因进行检测,结果发现neo基因没有在血液水平和消化道组织中发生漂移。通过PCR技术对试验仔猪肠道细菌中neo基因进行检测,在肠道细菌基因组中没有检测到neo基因的存在。检测结果表明,仔猪血液、肠道细菌和消化道组织等都没有发生neo基因的漂移。

具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶功能的家蚕l(3)neo18基因的克隆与表达特征

果蝇l(3)neo18基因可以通过P转座子诱发致死突变,编码的蛋白质具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶(ND)的功能。利用生物信息学、cDNA末端快速扩增(RACE)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法,克隆了家蚕l(3)neo18同源基因,分析了基因结构与表达谱。Bm-l(3)neo18基因(EU826676)的cDNA全长为868 bp,由573 bp的完整开放读码框(ORF)序列、25 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和251 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码蛋白质为190个氨基酸残基,分子质量22.7 kD,pI 9.60。Bm-l(3)neo18基因由3个外显子和2个内含子组成,定位于家蚕第3染色体,位于nscaf2930的1 203.8-1 205.6 knt。Bm-l(3)neo18蛋白质在1-185氨基酸残基位置为ND的SGDH亚基保守区,在61-83氨基酸残基位置具有一个保守的跨膜区域。采用Clustal W进行多序列比对发现,Bm-l(3)neo18与埃及伊蚊等昆虫ND具有50%以上的蛋白质同源性,ND的保守区域高度一致,NJ法分子进化分析也显示Bm-l(3)neo18与昆虫ND进化上同源。该基因除在家蚕卵期的表达量较低外,在幼虫、蛹和蛾期均有较高表达,且存在组织差异性。

逆转录病毒介导的标记基因neo导入恒河猴原代肌肉母细胞的实验研究

目的 :探索逆转录病毒介导的neo基因导入恒河猴原代肌肉母细胞的转染条件和方法。方法 :逆转录病毒上清在不同条件下与肌肉母细胞共同培养 ,观察肌肉母细胞体外增殖情况 ;用免疫荧光染色和流式细胞仪分析在转染过程中肌肉母细胞的表型Thy 1,NCAM和Desmin的变化 ;克隆PCR分析不同情况下导入基因的转染率和评价导入靶细胞标记基因的稳定性。结果 :含有 2 0 %FCS ,5 %鸡胚液的F10细胞培养液培养肌肉来源的干细胞能获得高纯度的肌肉母细胞Thy 1(85 0± 5 0 ) % ,NCAM (96 7± 5 8) % ,Desmin (95 7± 2 1) % ,而且这些表型不受转染的影响 ;持续暴露于病毒载体上清抑制肌肉母细胞的体外增殖 ;每天肌肉母细胞暴露于病毒载体上清 6h ,可获得 (6 3 9± 7 3) %的转染率 ,而且细胞体外增殖不受影响 ,转染后继续体外培养 2个月 ,转染率不下降。结论 :逆转录病毒介导的neo基因能高效率的导入肌肉母细胞 ,而且能稳定地整合到细胞DNA内 。

人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建

目的构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST)。经G418(600μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养。采用免疫细胞化学法、RTPCR和放射免疫法检测转染细胞亮氨酸脑啡肽(LEK)的表达及分泌,同时检测Neo基因的存在以证实转染成功。结果重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和950bb片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE亚克隆成功。Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染至IAST中,筛选获得IAST/hPPE和IAST/Neo两个细胞株,LEK免疫染色均阳性,但平均光密度结果显示IAST/hPPE的LEK表达明显强于IAST/Neo和IAST(P<0.01)。IAST/hPPE细胞与IAST/Neo和IAST细胞相比,hPPEmRNA表达水平和培养上清液中LEK的分泌量明显增高(P<0.01),而IAST与IAST/Neo细胞相比无显著性差异(P>0.05)。结论成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/hPPE),为该细胞移植用于镇痛的研究奠定了基础。

山羊Myostatin基因打靶载体的构建

根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊的Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1·4kb、4·5kb。将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已知发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%。对目的片段与载体进行酶切后定向连接形成转基因结构,经序列测定后,证明其插入方向和位置完全正确,构建表达Neo、Tk基因的哺乳动物双标记转基因载体,并命名为ploxp-M。

带新霉素抗性的萤光素酶报告载体的构建

目的:构建带新霉素抗性的萤光素酶报告载体。方法:设计扩增新霉素抗性基因neo,克隆入萤光素酶报告载体pGL3,得到pGL3-neo。分别比较pGL3、pGL3-CMV promoter瞬时转染组和经G418筛选的pGL3-neo、pGL3-neo-CMV promoter稳定转染组细胞萤光素酶活性。结果:PCR扩增出neo表达单元;酶切和DNA测序分析鉴定得到带新霉素抗性的萤光素酶报告质粒pGL3-neo。G418筛选可获得稳定转染pGL3-neo细胞株和稳定转染pGL3-neo-CMV promoter的细胞株。荧光检测显示:瞬时转染pGL3组、pGL3-CMVpromoter组及稳定转染pGL3-neo组、pGL3-neo-CMVpromoter组萤光素酶活性值分别为1047±86、1504±107和34819±1479、456109±15791,稳定转染组萤光素酶活性均高于瞬时转染组,P<0.05。结论:成功构建了带新霉素抗性的萤光素酶报告基因载体,使报告基因检测数据的敏感性和可靠性显著提高。

IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn UK融合基因为目的基因 ,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力 ,然后挑选高表达的克隆 ,通过MTX加压扩增 ,以提高IIn UK融合基因的拷贝数及表达水平。结果与讨论 :构建了 5种新型真核表达载体 ,并筛选出优化的真核表达载体 ,通过MTX加压扩增 ,实现了IIn UK融合基因在CHO细胞中的高表达 ,表达量达到 10 μg/ (10 6细胞·2 4h )。