药用植物胡黄连ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的优选胡黄连稳定的ISSR-RCR反应体系。方法采用4因素(dNTRs、Mg2+、Taq酶、引物)4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法。结果适于胡黄连的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素最佳浓度分别为10×buffer2.5μl,dNTPs 150μmol/L,Mg2+1.5mmol/L,Taq酶1U,引物0.5μmol/L,DNA20 ng或10×buffer 2.5μl,dNTPs 150μmol/L,Mg2+2 mmol/L,Taq酶0.5 U,引物0.4μmol/L,DNA20 ng。结论对于胡黄连ISSR-RCR试验,一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系。

高山濒危药用植物胡黄连组织结构与环境适应性研究

目的:对濒危高山药用植物胡黄连进行组织结构、高山环境适应性研究。方法:常规石蜡切片法和叶表皮临时制片法。结果:胡黄连多数植株地上茎不明显,极少数的植株有明显而直立的地上茎;叶片为等面叶,叶表面存在2种类型腺毛,气孔为不定式;地上茎中存在发达的机械组织,根状茎中分布有木栓层、厚角组织;叶片、地上茎、根状茎中均有大量通气组织分布。结论:胡黄连组织中存在适应高山环境的典型构造,但也有明显区别于其它高山植物的特异特征,高山植物对环境适应方式具有多样性。

基于cpDNA trnL-F序列的胡黄连保护遗传学研究

胡黄连为特产中国-喜马拉雅特有高山植物,作为常用中、藏药材,受到灭绝性采挖,作为濒危和二级保护植物亟待科学的保护。该研究以云南和西藏7个野生居群91个个体为材料,基于cpDNA trnL-F非编码序列测序分析胡黄连的遗传多样性和遗传结构,分析显著进化单元,确立优先保护居群并提出科学的保护策略。结果表明：胡黄连trnL-F序列长度为871～876 bp,根据序列的核苷酸变异共鉴定出5个单倍型,西藏占有2个单倍型,云南占有3个单倍型,西藏和云南2个地区的所有单倍型均不共享。胡黄连具有较低的单倍型多样性（Hd=0.434 19）和核苷酸多样性（Dij=0.004 66）。种群间分化度（Fst=0.864 520）和基因流（Nm=0.04）、居群间的遗传分化水平（G_（ST）=0.916）、AMOVA分析（0.78%的遗传变异发生在居群内,60.97%的遗传变异发生在地区内居群间,38.25%的遗传变异发生在地区间）均表明,胡黄连居群间存在明显遗传分化。多数一致性树将胡黄连划分为3个进化分支（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）,这3个分支均与地理相关,分支Ⅰ分布于横断山区的4个居群,分支Ⅱ是分布于东喜马拉雅的一个居群,分支Ⅲ是分布于喜马拉雅中段的2个居群。3个分支分属于3个＂进化显著单元（ESU）＂。这3个ESU中白马雪山、茨中、定日、波密、聂拉木五个居群都需要保护,建议现阶段应优先保护的居群是云南白马雪山和西藏波密居群,以就地保护为主。

胡黄连SRAP反应体系的建立与引物筛选

目的:建立胡黄连SRAP的反应体系,并筛选出适合胡黄连的引物组合,为胡黄连的遗传多样性研究奠定基础。方法:采用5因素(dNTP、Mg2+、Taq酶、引物、DNA)4水平正交试验一步法建立SRAP-PCR的反应体系,采用梯度温度法筛选PCR反应程序的最佳退火温度,对已发表的SRAP引物组合进行了筛选。结果:胡黄连SRAP-PCR的最佳反应体系,即20μL反应体系:10×buffer 2μL,dNTP 150μmol.L-1,Mg2+3mmol.L-1,Taq酶2U,引物为0.5μmol.L-1,DNA为20ng,DMSO 1μL;最适的退火温度是30.0℃～33.2℃;最适的引物组合为Me1Em1,Me1Em2,Me1Em3,Me3Em3,Me1Em4,Me2Em4,Me3Em4,Me4Em4,Me1Em5,Me3Em5,Me4Em5,Me3Em6,Me4Em6。结论:该体系是适合胡黄连SRAP-PCR反应的最适宜体系,为今后胡黄连遗传多样性研究奠定了基础。