骨髓间充质干细胞在梗死心肌移植再生后nesprin蛋白表达的实验研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植到急性心肌梗死区心肌样细胞再生后ne-sprin蛋白的表达情况。方法:大鼠16只,随机分为实验组和对照组,每组8只。利用密度梯度分离法和贴壁培养MSCs,流式细胞仪检测MSCs表面相关抗原、DAPI标记MSCs备用;SD大鼠开胸手术结扎心脏冠脉左前降支建立心肌梗死模型,并在实验组梗死区注射MSCs,对照组注射DMEM;术后3周取梗死区心肌,利用免疫细胞学化学方法鉴定肌节肌动蛋白和肌钙蛋白的表达,免疫荧光技术和蛋白质印迹鉴定nesprin蛋白在MSCs移植后的表达。结果:MSCs移植到梗死缺血区3周后可以用DAPI示踪、并有心肌细胞特异蛋白呈阳性表达;免疫荧光和蛋白质印迹鉴定在MSCs移植前后有nesprin蛋白的表达,移植后出现nesprin蛋白表达量的增加。结论:MSCs在梗死心肌内移植具有分化再生的能力,nesprin蛋白在MSCs移植后出现表达量的增加,可能在MSCs分化为心肌细胞样过程中起到一定的作用。

Nesprin蛋白对骨髓间充质干细胞的影响

目的构建nesprin蛋白siRNA慢病毒载体(LV-siNesprin),感染骨髓间充质干细胞(MSCs),观察nesprin蛋白对MSCs的影响。方法针对nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,并将4对oligo退火成双链DNA,测序鉴定。将4种miRNA干扰质粒(SR-1、SR-2、SR-3、SR-4)转入大鼠血管平滑肌细胞,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blotting)检测干扰效应,筛选最佳干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应获得含干扰序列的LV-siNesprin+绿色荧光蛋白(GFP),包装慢病毒,测定病毒滴度。LV-siNesprin+GFP转染MSCs,Western blotting鉴定比较nesprin蛋白表达情况(分为LV-siNesprin+GFP组、GFP对照组和正常细胞组),用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞核形态改变和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测MSCs感染LV-siNesprin后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖情况(分为LV-siNesprin+GFP组、GFP对照组和正常细胞组)。结果测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和Western blotting筛选出最佳干扰miRNA质粒SR-3,成功构建LV-siNesprin,包装慢病毒,病毒悬液的活性滴度为1×106ifu/ml。LV-siNesprin转染MSCs后,nesprin蛋白表达明显下降,出现细胞核融合、核碎裂等形态学改变;MTT法检测显示,LV-siNesprin+GFP组MSCs增殖速度较GFP对照组和正常细胞组减慢。结论 Nesprin蛋白对MSCs核膜稳定维持核膜空间结构起作用,并利于细胞增殖更新。

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景:Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何?目的:构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞。方法:针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度。慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论:测序证实合成的4对miRN Aoligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siN esprin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106TU/mL。慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞。