产气荚膜梭菌重组NetB毒素细胞毒性作用研究

坏死性肠炎B样毒素(NetB)是新近发现的由产气荚膜梭菌产生与鸡坏死性肠炎发生密切相关的成孔毒素。本研究通过观察NetB毒素对HeLa细胞以及小鼠肠道的毒性损伤作用,进一步阐明该毒素在鸡坏死性肠炎发病过程中的作用。采用PCR方法扩增NetB毒素基因片段,构建重组表达质粒pGEX-NetB并转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达获得重组NetB蛋白,纯化鉴定后用复性的蛋白质进行HeLa细胞毒性试验。结果如下:光镜观察可见,NetB蛋白作用2h后,部分细胞出现肿胀变圆,少数细胞破裂,细胞质外溢;12h后,细胞已无正常形态,细胞圆缩,细胞因坏死脱落溶解空隙增大,偶见病变细胞聚集成团;48h后,细胞坏死明显,只残存细胞溶解后的碎片。HE染色后观察可见病变细胞染色不均,细胞膜碎裂而不完整,细胞质外溢。电镜观察可见,病变细胞缺少完整的细胞膜结构,细胞质外溢,细胞核形状不规则,核膜膨出,核仁边集,亚细胞器也出现不同程度的病变,其中线粒体病变最为明显。通过对小鼠病理模型观察可见,接种NetB毒素小鼠发病迅速,腹部膨大,肠道臌气明显;组织学观察表明接种小鼠内脏器官出现不同程度的病理变化,以小肠最为明显,表现为肠黏膜损伤,绒毛断裂、脱落等。NetB毒素可引起HeLa细胞细胞膜损伤而呈现细胞毒性;小鼠体内试验NetB毒素可复制出NE典型病变,表明NetB毒素与NE的发病密切相关。

产气荚膜梭菌NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌疫苗免疫的组织学研究

为了评估表达产气荚膜梭菌NetB毒素的重组植物乳酸杆菌口服活菌疫苗对鸡的免疫保护效果,分别进行了重组活菌疫苗的免疫和产气荚膜梭菌攻菌试验。设置3组免疫组雏鸡,于7~28日龄分别连续免疫pSIP409空载体植物乳酸杆菌、pSIP409-Net B重组植物乳酸杆菌和灭菌PBS;设置4组攻菌组雏鸡,免疫方法同上,免疫后于43~47日龄连续口服产气荚膜梭菌(设置PBS免疫组不攻菌只口服等量PBS对照)。通过免疫后肠道分离重组菌、病理组织学检查疫苗对雏鸡组织器官有无损害作用及保护作用;攻菌后细菌分离计数、剖检肠道病变评分来评价疫苗的免疫水平。结果显示,免疫后2周仍可在免疫鸡的小肠、盲肠段分离到重组菌;组织学检查发现与对照组相比重组疫苗的免疫没有对雏鸡组织器官产生损害作用;NetB攻菌组的肠道损伤情况较空载体攻菌组和PBS攻菌组轻微;NetB攻菌组的肠道病变评分低于空载体攻菌组和PBS攻菌组。表明所构建的重组口服活菌疫苗安全有效,结果为重组植物乳杆菌表达系统作为口服疫苗应用提供了理论依据。

产气荚膜梭菌NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌疫苗免疫保护性研究

为了评估表达产气荚膜梭菌NetB毒素的重组植物乳酸杆菌口服活菌疫苗对鸡的免疫保护效果,分别进行了重组活菌疫苗的免疫和产气荚膜梭菌攻菌试验。免疫组雏鸡分为3组,于7~28日龄分别连续免疫p SIP409空载体植物乳酸杆菌、p SIP409-NetB重组植物乳酸杆菌和灭菌PBS;攻菌组雏鸡免疫方法同上,于43~47日龄连续口服产气荚膜梭菌(设置PBS免疫对照组和不攻菌只口服等量PBS对照组)。通过采用ELISA检测抗体动态变化,观察雏鸡体重变化和免疫器官发育情况以评价疫苗的免疫效果。结果显示,NetB组特异性抗体Ig G和s Ig A水平随日龄增长呈现上升趋势,且与未免疫对照组存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01);NetB攻菌组各项指标在短暂下降后很快升高,且明显高于未免疫对照组雏鸡(P<0.01)。NetB组周增重14日龄后均高于其他组,且35日龄开始与其他组差异极显著(P<0.01);攻菌组体重变化总趋势是NetB攻菌组最高,其次是空载体攻菌组(P<0.05),PBS攻菌组最低(P<0.01)。免疫组在免疫结束时胸腺和脾脏指数呈明显上升趋势,NetB组的这两项指数分别在56日龄和49日龄达到最高,法氏囊指数在28日龄下降,随后稳步上升;虽然攻菌后各免疫器官指数上升趋势变缓,但NetB攻菌组的各项指数在各时间点均与其他组差异极显著(P<0.01)。表明重组口服活菌疫苗对产气荚膜梭菌攻击雏鸡起到很好的保护作用,所构建的重组疫苗安全有效,结果为重组植物乳酸杆菌表达系统应用于口服疫苗提供了理论依据。

产气荚膜梭菌NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌的构建

选择产气荚膜梭菌坏死性肠炎毒素B(NetB)为抗原,构建产气荚膜梭菌NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌,利用植物乳酸杆菌穿梭载体pSIP409构建重组质粒pSIP409-NetB,经双酶切鉴定和序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行SppIP诱导表达。Western blot证明重组蛋白表达成功,并且主要以包涵体形式存在,NetB重组蛋白相对分子质量为36 ku。重组质粒pSIP409-NetB电转化植物乳酸杆菌NC8细胞,PCR和双酶切鉴定正确后进行SppIP诱导表达。Western Blot和间接免疫荧光鉴定表明构建的重组植物乳酸杆菌具有诱导分泌NetB蛋白的能力,可作为黏膜免疫的候选抗原。