针对人NeuroD基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人神经源性分化蛋白基因（NeuroD）RNA干扰慢病毒表达载体。方法根据已公布的NeuroD基因序列（GenBank：NM-002500），设计并合成4对shRNA（NeuroD1～D4），与载体pcDNAr^TM6．2-GW／EmGFP-miR连接，构建pcDNA”6．2-GW／EmGFP—miR-NeuroD表达载体，转化入感受态细胞DH5a；real—timePCR技术检测pcDNA^TM6．2-Gw／EmGFP_miR_NeuroD表达载体对293T细胞内靶基因的干扰效果。将筛选出的干扰载体pcDNA”6．2-Gw／EmG—FP-miR—NeuroDl与慢病毒载体pLenti6．3／V5-DEST经酶切后连接，构建慢病毒表达载体pLenti6．3-EGFP-Neur0D1-miR。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒（PackagingMix）共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超速离心浓缩，并测定滴度。采用PCR法对重组载体进行鉴定，利用绿色荧光蛋白作为报告基因，对病毒滴度和感染效率进行检测。结果成功构建针对靶基因的4个干扰质粒，测序结果表明，4个pcDNA^TM6．2-GW／EmGFP-miR—NeuroD表达载体序列与参考序列一致，real—timePCR检测显示以pcDNA^TM6．2-GW／EmGFP—miR-NeuroDl的沉默效应最佳（P〈0．01）。将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6．3-EGFP—NeuroDl-miR转染至293T细胞株，酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期一致，病毒滴度达1．18×10^8ifu／mL。结论成功构建、筛选了针对人NeuroD基因的RNA干扰慢病毒表达载体。

青少年的成人起病型糖尿病家系NEUROD1基因突变的筛查与功能解析

目的·筛查青少年的成人起病型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young,MODY)家系中NEUROD1基因突变,分析突变与中国人MODY6发病的相关性及其潜在的致病机制。方法·采用PCR-直接测序法对96例GCK/MODY2、HNF1A/MODY3、HNF1B/MODY5突变阴性的中国MODY先证者进行NEUROD1突变筛查,同时比较96例MODY先证者与100例非糖尿病对照者NEUROD1基因变异的基因型频率。采用从头建模法构建NEUROD1蛋白野生型和突变体的3D结构,采用双荧光素酶报告基因系统检测野生型和突变体蛋白对胰岛素基因转录活性的影响。结果·在一个MODY家系中发现NEUROD1基因杂合错义突变Glu59Gln (NM_002500.5,c.175G>C)。3D结构分析发现,该突变将野生型中带负电荷的Glu59转化为突变中不带电荷的Gln59,导致两个盐桥键Glu59-Arg54和Glu59-Lys88缺失,并形成一个新的氢键Gln59-Arg54。与野生型相比,Glu59Gln突变体的胰岛素基因转录活性下降36.3%(P<0.05)。与非糖尿病对照相比,96例MODY先证者中Ala45Thr (G-A)变异的AA+GA基因型频率显著升高(P=0.002)。结论·Glu59Gln突变改变了NEUROD1蛋白N端的分子构象,导致其胰岛素基因转录活性显著下降,是该家系突变携带者胰岛素分泌缺陷的原因。Ala45Thr变异与MODY6先证者糖尿病发病年龄的提前有关。

Neurod1与内耳感觉神经及毛细胞发育的相关研究

本文主要介绍了Neurod1在内耳感觉神经元及毛细胞发育中的相关研究。Neurod1是b HLH转录因子家族中的重要一员,它能促进感觉神经元前体细胞分化为成熟感觉神经元细胞。在内耳中,Neurod1主要表达于感觉神经元细胞,部分感觉上皮也有表达。Neurod1基因条件性敲除小鼠可出现听力及平衡障碍,其内耳感觉神经元细胞大量缺失,同时内耳中的传入及传出神经也存在缺陷。Neurod1基因敲除小鼠螺旋神经节中还可出现异位毛细胞的生长。在内耳发育过程中,Neurod1基因与多种基因相互调控,协同促进内耳发育成熟。如Neurog1、Atoh1、Sox2、Nhlh1等。

早发2型糖尿病家系NeuroD1基因突变筛查与功能研究

目的在中国人早发2型糖尿病家系先证者中筛查NeuroD1基因突变／变异，并研究其功能及携带者家系的临床表型和遗传特点。方法用PCR-直接测序法检测85例早发、95例晚发2型糖尿病家系先证者和87名非糖尿病对照者NeuroD1基因突变／变异，比较筛查到的组间突变／变异的基因型及等位基因频率的差异。分别构建含小鼠NeuroD1（mND1）基因cDNA的野生型、突变型表达质粒载体和与人胰岛素基因启动子相连的荧光素酶报告基因质粒载体，共转染至大鼠INS-1细胞。分别检测荧光素酶活性，比较野生型、突变体蛋白对人胰岛素基因转录活性的影响。结果在一早发先证者发现新突变S159P（T→C），它与来自父方的4例携带突变的糖尿病患者遗传上呈共分离；与野生型相比，S159P突变体导致胰岛素基因转录活性下降25％；检测到常见多态A45T（G→A），与非糖尿病组及晚发2型糖尿病组相比，早发组该变异的AA＋GA基因型频率显著增加（P=0．006和P=0．014）。结论NeuroD1基因S159P突变促进该早发2型糖尿病家系的发病。A45T变异增加中国人早发2型糖尿病的易感性，或与之呈连锁不平衡，该变异可能影响中国人2型糖尿病的发病方式，即早发而不是晚发。

2型糖尿病NEUROD1基因的研究

47例 2型糖尿病 (均 40岁以后发病 )家系先证者PCR SSCP检测出两种NEUROD1基因变异 ;Ala45Thr和Ile15 6Ile。 12 2例 40岁以后发病的 2型糖尿病患者和 13 2例正常对照Ala45Thr基因型和基因频率分布差异无显著性 ,提示NEUROD1基因Ala45Thr突变不是中国人 2型糖尿病的重要遗传因素。