多氯联苯对胎鼠神经干细胞Nnat基因表达的影响

目的探讨环境污染物多氯联苯Aroclor 1254对神经发育损伤的作用机制.方法不同剂量的Aroclor 1254(A1254)作用于胎鼠的神经干细胞(NSC)72 h,通过实时定量RT-PCR检测Neuronatin(Nnat)mRNA的表达,Western blot检测Nnat蛋白质含量和流式细胞技术检测细胞凋亡情况.结果 (1)免疫荧光显示所培养细胞表达Nestin,且能进一步被诱导分化;(2)随着A1254剂量增加,Nnat mRNA和蛋白质表达水平下降,NSC细胞凋亡增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论多氯联苯可能通过下调Nnat基因表达,神经细胞凋亡增加,导致胎儿的神经发育损伤.

Neuronatin基因研究进展

Neuronatin (Nnat)是最近克隆的脑特异表达的新基因 ,在大脑发育过程中被选择性地剪接 .人Nnat基因全长 3 973bp ,含有 3个外显子和 2个内含子 .NnatmRNA有α和β两种剪接形式 ,分别编码 81个和 5 4个氨基酸 ,两者具有同一相位的开放阅读框架 ,差别在于 β形式中间的外显子被剪切掉 .人Nnat是单拷贝基因 ,定位于染色体 2 0q11 2～ 12 .小鼠Nnat基因定位于 2号染色体末端 .该基因是印记基因 (imprintedgene) ,仅在父本来源的等位基因表达 ,而母本来源的等位基因则被甲基化不能表达 .该基因在胚胎期及出生后早期大量表达 ,而在成年和衰老动物大脑中表达明显降低 ,因此推测该基因与大脑的发育和分化密切相关 .成年动物中垂体前叶是NnatmRNA唯一强表达的地方 .推测其蛋白质产物具有疏水N端和亲水C端 ,是跨膜蛋白 ,其确切功能尚属未知 .

小鼠Neuronatin基因真核表达载体构建及其蛋白产物的检测

【目的】构建基因Nnat的真核表达载体pEGFP-N1/Nnat并在真核细胞中表达目的蛋白。【方法】RT-PCR法扩增Nnat基因编码区(ORF),利用基因克隆技术构建真核表达载体,酶切及测序进行鉴定;载体构建成功后转染HepG2细胞,观察融合蛋白在细胞中的定位,Western blot检测其在真核细胞中的表达。【结果】RT-PCR法扩增出Nnat基因的两种亚型,相应的双酶切能够获得插入的目的基因片断,测序分析未发现突变;荧光显微镜观察到两种融合蛋白在细胞中分布与EGFP明显不同,融合蛋白主要分布在细胞质中,细胞核中没有表达;Western blot结果可见两条明显的特异条带。【结论】小鼠Nnat基因真核表达载体构建成功,并能在真核细胞中表达出目的蛋白。

猪NNAT基因印记鉴定及单核苷酸多态性分析

本实验旨在探究猪NNAT(Neuronatin)基因印记状态、遗传多态性及其与胴体和肉质性状的关系,为印记基因成为猪肉质性状遗传改良的分子标记提供理论依据。通过PCR产物直接测序发现在NNAT基因3’UTR区存在一处C/T突变,鉴定了NNAT基因在梅山猪与大白猪正反交产生的65d胚胎的背部脂肪组织中的印记状态;在起始密码子上游-107 bp处存在一处G/A突变,利用PCR-Alu I-RFLP技术在大白猪、长白猪和梅山猪中进行了基因分型,并在279头大白猪与梅山猪杂交产生的F2代群体中进行性状关联分析。结果表明,猪NNAT基因在所检测组织中为父本表达、母本印记;-107 bp处的G/A突变与眼肌高、眼肌宽、眼肌面积、背最长肌含水量、背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹显著相关。

Nnat基因在大鼠脑发育过程中表达的初步研究

目的:观察Nnat基因在大鼠脑发育过程中基因表达的变化规律,藉以探讨Nnat在神经系统发育过程中的作用。方法:采用半定量RT-PCR法分析出生前后大鼠脑内Nnat表达水平的变化,Western blot检测Nnat蛋白的表达。结果:在大鼠胚胎第9 d(E9)脑内Nnat mRNA开始表达,但表达量较低,以后其表达量逐渐升高,出生前有轻微下调。出生后大鼠的不同脑区Nnat mRNA的表达量都呈现下降趋势,60 d时达到较低的水平。Nnat蛋白在不同脑区都具有表达,但不同亚型蛋白量的相对比例不同。结论:Nnat基因在胚胎期及出生后大鼠脑内的表达量与中枢神经系统发育及分化过程的时间上有一定的同步性,提示Nnat的作用可能与神经元分化的调节有关。

猪Neuronatin基因在pTr2细胞内葡萄糖转运中的功能研究

本研究旨在探索印记基因NNAT 2个转录本NNAT-α、NNAT-β在猪胎盘滋养层细胞(pTr2)中的功能。实验通过NCBI数据库公布的猪NNAT-α、NNAT-β的CDs序列信息设计引物,并构建了pcDNA3.1-NNAT-α和pcDNA3.1-NNAT-β真核表达载体,经过双酶切、连接转化、测序鉴定后,将表达载体转染至pTr2细胞,48 h后通过酶标仪检测细胞内葡萄糖含量的变化,RT-PCR检测NNAT基因、葡萄糖转运基因(GLUT1、GLUT3)和PI3K-AKT通路基因的表达。结果表明在pTr2细胞中过表达NNAT-α、NNAT-β可显著提高细胞内葡萄糖含量、葡萄糖转运基因(GLUT1、GLUT3)和PI3K-AKT通路基因mRNA的表达量。

neuronatin shRNA真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:获得能持续干扰neuronatin(nnat)基因表达的细胞,观察nnat基因沉默对神经细胞发育与分化的影响,为研究基因功能奠定基础。方法:构建含nnat基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,将质粒转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12,RT-PCR方法筛选出最有效干扰质粒,稳定转染PC12细胞后观察细胞表型变化,免疫荧光检测nnat蛋白表达,NGF诱导观察nnat表达下调对细胞分化的影响。结果:成功构建并筛选出有效的靶向nnat基因的shRNA真核表达载体;载体稳定转染PC12细胞之后能特异性沉默nnat基因的表达,PC12细胞长出突起,向神经元方向分化,加入诱导因子NGF后能促进突起生长。结论:nnat可能是作为神经分化抑制因子在神经发育与成熟过程中发挥作用。

Neuronatin对人视网膜色素上皮细胞增殖迁移的影响

目的:研究胚胎时期表达部位广泛、丰度高,而成年后分化表达的印记基因Neuronatin(Nnat)的两种剪接形式Nnatα和Nnatβ对人视网膜色素上皮细胞(RPE)增殖、迁移的影响。方法:构建Nnatα、β两种剪接形式的表达质粒,转染RPE获得表达该基因的稳定表达细胞株;CCK-8实验检测稳定表达细胞株的增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期,细胞划痕实验检测其迁移能力。结果:成功构建了Nnatα和Nnatβ表达质粒,并获得了Nnatα和Nnatβ基因稳定表达PRE细胞株。CCK-8实验结果显示cNNATα组与对照组相比较,增值率为23.33%(P<0.05),cNNATβ组相较于对照组无显著性差异,细胞周期分析cNNATα组和cNNATβ组细胞在G2-S期的百分率分别为18.60%、11.11%,对照组细胞的为9.94%;相较于对照组,cNNATα组的细胞迁移能力显著增强,cNNATβ组的细胞迁移能力微弱增强。结论:Nnatα对RPE有一定的增殖作用,其影响主要在S期;同时,Nnatα显著促进RPE细胞的迁移能力。

Neuronatin在人体常见肿瘤中的表达及对肿瘤细胞增殖的影响

目的:研究印记基因Neuronatin(NNAT)在人体常见肿瘤中的表达情况及其两种编码产物NNATα和NNATβ对肿瘤细胞增殖的影响。方法:运用组织芯片免疫组化技术对一些人体常见肿瘤及其对应正常组织中NNAT的表达进行系统检测;同时利用腺病毒载体技术,将NNATα和NNATβ分别导入人结肠癌细胞系SW620,并用实时细胞分析仪和平板克隆实验分析细胞增殖能力的变化。结果:①免疫组化结果显示:NNAT在食道鳞癌,结肠腺癌,直肠腺癌,胰腺腺癌,乳腺非特殊性浸润性导管癌,宫颈鳞癌,子宫内膜癌,膀胱移行上皮癌,肺鳞癌,皮肤鳞癌以及前列腺腺癌11种肿瘤组织,肾上腺,皮肤,睾丸,脑,骨骼肌,胰腺6种正常人体组织,以及慢性结肠黏膜炎与慢性肝炎2种炎性组织中呈阳性。②体外细胞增殖实验结果显示,NNATα对人结肠癌肿瘤细胞增殖有一定的抑制作用。结论:NNAT基因在多种人体肿瘤组织中表达,其α片段的表达对于结肠癌细胞系SW620增殖具有轻微抑制作用。