重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析

目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。

蛇神经毒素的表达和鉴定

抽提中华眼镜蛇毒腺总RNA ,通过反转录PCR扩增cobrotoxincDNA ,克隆并测序。该cDNA编码 83个氨基酸 ,包括 2 1个氨基酸的信号肽和 6 2个氨基酸的成熟蛋白。该成熟蛋白的氨基酸序列和通过蛋白测序从台湾眼镜蛇鉴定的Cobrotoxin完全一致。PCR扩增编码Cobrotoxin的DNA ,并亚克隆到表达载体 pMAL P2 。此外 ,通过合成寡核苷酸片段 ,拼接成完整的CM 11基因 ,并将其克隆至 pMAL P2 。经IPTG诱导 ,两种神经毒素基因在大肠杆菌中都得到高效的可溶性融合表达。表达产物通过SDS PAGE和蛋白印迹杂交加以鉴定。表达的融合蛋白经过Sepharose 6B amylose亲和色谱和DEAE SepharoseFF离子交换色谱得到有效纯化。经Xa因子酶切后得到的两种重组神经毒素都具有小白鼠体内毒性。

新型降钙素的基因合成与克隆表达

借助计算机辅助设计了一种新的人降钙素类似物 (新型降钙素 )。根据密码子偏爱性原理及基因工程操作原则设计了它的基因 ,运用化学法和酶法相结合的技术合成了该基因 ,并克隆到质粒 pUC19中 ,DNA测序验证正确。该基因被克隆到融合型表达载体pGEX 2T中 ,重组融合型表达载体nCT/ pGEX 2T转化E coliBL2 1,培养表达 ,SDS PAGE分析可见Mr 约 310 0 0的融合蛋白带 ,融合蛋白占细胞内总蛋白的 34%。WesternBlotting分析证明该新型降钙素获得表达。

鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽融合基因植物表达载体的构建

根据基因工程操作方法和植物偏爱密码子原则,设计了鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽融合基因,并在融合基因前端加上AMVRNA45'-UTR序列和6×His标签,在融合基因后边加上一个甘氨酸。通过SacI和SmaI双酶切pUC(AMV/CGRP/msCT)获得融合基因,用T4DNA连接酶连到植物表达载体pBI121上,构建重组质粒pBIAMV/CGRP/msCT,再转化到E.coliDH5α中保存。通过DNA测序验证表达载体构建成功。

抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达策略

抗菌肽抗菌谱广、活性稳定,具有与抗生素不同的抗菌机制,在抑杀病原微生物的同时不易产生耐药性,在免疫调节和抗感染方面具有巨大的发展潜力,能够发展为取代抗生素的新型药剂,在食品、饲料、畜禽养殖等领域也具有重要的应用价值。基因工程技术是降低抗菌肽生产成本的主要方式,其中融合表达在提高抗菌肽产量方面起到了重要作用。综述了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的国内外研究进展,探讨了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的策略,并对高通量融合表达抗菌肽提出了建议。

Pichia pastoris酵母中表达人源中和性抗甲型肝炎病毒scFv-Fc融合抗体的研究

为了探讨人源抗甲型肝炎(甲肝)病毒scFv-Fc融合抗体在酵母中的表达特性,将获得的人源抗甲肝病毒中和性单链可变区抗体(scFv抗体)基因克隆入含信号肽及人IgG1Fc抗体基因的酵母细胞表达载体中,获得了一株中和性人源抗甲肝病毒pPiscFv-FcHA16融合抗体的分泌表达,并对表达产物进行了纯化。同时对表达产物的生物学特性进行了一系列鉴定。表达的pPiscFv-FcHA16融合抗体为具有不同糖基化形式的同源二聚体,与相应的CHO细胞表达的IgG抗体相比,pPiscFv-FcHA16融合抗体仍保持很好的抗原结合活性,以及与中和性鼠抗甲肝病毒单克隆抗体的竞争抑制能力。同时也保持了对甲肝病毒的体外中和活性。这些结果表明,在酵母中表达的单链可变区(scFv)与IgG1Fc区的融合抗体具有很好的生物学活性,有希望用做体外诊断,用纯化相应的抗原,或者可能用于体内预防与治疗。

人生长分化因子15的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化、鉴定人生长分化因子15(GDF-15),制备其多克隆抗体。方法:从人结肠癌细胞系HT29的cDNA扩增出GDF-15基因片段并插入pET-32a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组GDF-15,用镍亲和柱纯化,SDS-PAGE、Western印迹鉴定重组蛋白。用纯化的重组GDF-15免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,鉴定并检测其效价。结果:制备了pET-32a(+)-GDF-15表达载体;经IPTG诱导重组蛋白表达后,采用Ni亲和柱纯化蛋白,并经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定;免疫BALB/c小鼠后获得了GDF-15多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1∶100000,并应用于肿瘤细胞的GDF-15检测中。结论:用基因工程和免疫学方法制备了重组人GDF-15及其多克隆抗体,为后续的分子机制和靶向治疗研究奠定了基础。

猪圆环病毒2型结构蛋白Cap在果蝇S2细胞中稳定表达与鉴定的研究

为了表达猪圆环病毒2型(PCV-2)结构蛋白Cap并检测其表达情况,试验采用果蝇S2细胞真核表达的方法,通过扩增PCV-2 Cap蛋白的编码基因,与昆虫细胞表达载体pMT/Bip/V5-HisA连接构建重组表达载体pMT/Bip/V5-HisA-Cap,用重组表达载体与筛选质粒pCoHygro共转染S2细胞,再使用选择性培养基加压筛选出稳定的细胞株,表达Cap融合蛋白后,利用SDS-PAGE及Western-bolt研究表达产物的抗原性。结果表明:融合蛋白的分子质量约为31 ku,该蛋白能够与带有V5标签的抗体结合,说明PCV-2 Cap蛋白能在S2细胞中正确表达,并具有良好的抗原性。

抗菌肽融合表达研究进展

抗菌肽抗菌谱广、活性稳定,且具有与抗生素不同的抗菌机制,在抑杀病原微生物的同时不易产生耐药性,因而在食品、饲料、医药等领域具有重要的应用价值。基因工程技术是降低抗菌肽生产成本的主要方式,其中融合表达在提高抗菌肽产量方面起到了重要作用。文中综述了抗菌肽融合表达的国内外研究进展,探讨了部分融合标签用于抗菌肽表达的策略,并对今后的发展提出了自己的看法。

产气荚膜梭菌多毒素融合蛋白的表达与纯化及基因工程亚单位多价疫苗的制备

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的α、β2和ε毒素是病原的主要外毒素,也是制备预防该病基因工程亚单位多价疫苗的主要研究对象。本研究通过优化密码子、去除蛋白信号肽、选择亲水性与抗原性较好的序列、同时优化表达条件等方法的探索,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达的可溶性α-β2-ε融合蛋白;用该蛋白免疫小鼠后可产生较高水平的血清抗体,针对A、B、C和D型产气荚膜梭菌的免疫保护率分别为100%,100%,90%,100%;小鼠三免后7~14d的抗体效价达到峰值。本研究构建了多毒素融合蛋白表达载体Pet30a-α-β2-ε,并成功表达与纯化出了高效可溶性的目的蛋白,且表达出的融合蛋白具有良好的免疫原性,可以进一步用于羊三联四防基因工程亚单位疫苗的研制,具有较强的研究价值和应用前景。

融合表达载体pET32a/Trx-EK-MrVIB的构建及在大肠杆菌中表达

人工设计合成芋螺毒素基因Mr VIB来构建表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S进行诱导表达。菌体经超声破碎后利用Ni-NTA琼脂糖柱进行亲和层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析融合蛋白表达。结果表明融合表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB经PCR扩增和测序鉴定具有正确的开放阅读框。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,经一步亲和层析获得纯度大于90%的融合芋螺毒素达73.6 mg/L。本文成功构建了融合表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB,融合芋螺毒素Trx-EK-Mr VIB在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。