人源性神经营养素-6成熟肽基因融合表达载体的构建及表达产物的纯化

为了得到人源性神经营养素-6(N eurotroph in-6,NT-6)成熟肽片段,本研究以经测序鉴定的人源性NT-6 cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(Po lym erase cha in reaction,PCR)扩增得到NT-6蛋白成熟肽编码区基因片段;将该基因克隆到融合表达载体pGEX 1-λT,构建重组原核融合表达质粒pGEX-NT-6;在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy l-βD-th ioga lactos ide,IPTG)诱导的条件下,观察融合蛋白在大肠杆菌JM 109中的表达情况;利用蛋白回收试剂盒对表达产物进行纯化。结果表明经PCR扩增后,得到一分子量为460 bp左右的片段;含有该片段的重组质粒经电泳及双酶切鉴定表明,所得到的重组质粒即为含有目的片段的pGEX 1-NT-6;与带有pGEX 1-λT质粒的细菌相对照,pGEX 1-NT-6质粒转化的大肠杆菌JM 109,在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,该蛋白分子量为41 KD。获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量大约为15 KD的NT-6成熟肽。本研究成功构建了人源性NT-6成熟肽编码区基因融合表达载体,并纯化了其表达产物,为研究人源性NT-6的生物学功能奠定了基础。

鸡β-防御-素8 cDNA在大肠杆菌中的融合表达

为了评价鸡β-防御素的功能与基因工程化生产的可能性,从已构建的重组载体pGEM-T Easy-gal-8中克隆gal-8成熟肽cDNA,将该cDNA插入原核表达载体pGEX-6P-1中,构建表达质粒pGEX-6P-1-gal-8,然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。挑取阳性克隆菌用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果检测显示,融合表达的GST-gal-8蛋白大小约30 ku,经灰度扫描显示该融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的119 mg/L。用固定化的谷胱甘肽亲和层析柱进行蛋白纯化,融合蛋白经Prescission蛋白酶酶切并纯化获得了完整的gal-8成熟多肽。抑菌活性试验显示,表达的gal-8成熟肽对黄色微球菌有一定的抑菌活性。

斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)LEAP2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达

以斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏为基因克隆的材料,通过RT-PCR对编码LEAP2成熟肽区域41个氨基酸的cDNA片段(mLEAP2)进行克隆。根据斑点叉尾鮰与其他鱼类、哺乳动物及两栖动物等其他物种LEAP2成熟肽区域氨基酸序列的比对结果,发现存在14个保守的氨基酸残基,其中4个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端区域,在空间上可形成两对二硫键,推测与LEAP2的抗菌活性有关。进一步构建重组表达质粒pET32a-mLEAP2,使mLEAP2基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合,转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,在25℃下,经0.7 mmol/L IPTG诱导培养16 h后,成功表达了trxA-mLEAP2融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示,细胞经超声破碎后,上清和沉淀中均含融合蛋白,采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行纯化,得到了纯化的融合蛋白。

大鼠Myostatin蛋白成熟肽的原核表达及纯化

目的:利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达系统在大肠杆菌中表达纯化Myostatin成熟肽。方法:应用RT-PCR从大鼠的腓肠肌mRNA中逆转录扩增Myostatin成熟肽编码序列,克隆入原核表达载体pGEX-4T1中,IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用Western-blot用抗-GST抗体验证融合蛋白表达。融合蛋白经Glutathione-agarose色谱纯化。结果:PCR扩增的Myostatin基因序列与GenBank数据库中的序列一致;30°C,0.1mmol/LIPTG诱导16小时,GST-Myostatin融合蛋白获得优化表达,表达效率为25%;Western-blot证实融合蛋白的特异性表达。结论:成功构建融合蛋白GST-Myostatin重组基因,并在大肠杆菌中获得有效表达,为Myostatin抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定基础。