基于网络药理学探讨新止骨增生丸治疗膝骨关节炎的作用机制

目的 运用网络药理学方法探索新止骨增生丸治疗膝骨关节炎(KOA)的潜在作用机制。方法 利用中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库筛选新止骨增生丸的活性成分及其作用靶点;利用GeneCards、OMIM和DisGeNet数据库检索KOA疾病的相关靶点;通过Venny 2.1.0在线平台对新止骨增生丸的活性成分作用靶点与KOA疾病相关靶点映射取交集,得到新止骨增生丸治疗KOA的关键靶点(共同靶点);将共同靶点导入String平台构建蛋白相互作用(PPI)网络,并将结果导入Cytoscape 3.7.1软件进行拓扑分析,提取核心靶点;运用注释、可视化和集成发现(DAVID)数据库对核心靶点进行基因本体论(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,并利用Cytoscape 3.7.1软件构建“活性成分-关键靶点-通路”网络。结果 共获得活性成分54个,对应靶点262个,疾病靶点2459个,共同靶点142个,经过蛋白互作及拓扑分析,得到核心靶点13个, GO功能富集分析得到821个生物过程(BP), 94个细胞组分(CC), 139个分子功能(MF)和167条通路(P<0.05)。将“活性成分-核心靶点-通路”网络图进行拓扑分析,共筛选出槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚等12个核心成分,以及肿瘤坏死因子(TNF)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白细胞介素-6(IL-6)、血管内皮生长因子A (VEGFA)、白细胞介素-1β(IL-1β)等16个关键靶点。结论 新止骨增生丸可能通过槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等主要活性成分,作用于AKT1、TNF、VEGFA等核心靶点,通过高级糖基化终末产物-受体(AGE-RAGE)、TNF等信号通路,协同发挥对KOA的治疗作用。

HPLC法同时测定新止骨增生丸中麦角甾苷、柚皮苷和芒柄花素的含量

目的w建立同时测定新止骨增生丸中麦角甾苷、柚皮苷和芒柄花素含量的方法。方法w采用HPLC法。色谱柱为KromasilwC18柱（250wmm×4.6wmm,5μm）;流动相为甲醇-体积分数为0.1%的磷酸水溶液,梯度洗脱;流速为1.0wmwL·min^-1;检测波长为283wnm;柱温为35℃。结果w麦角甾苷、柚皮苷和芒柄花素的质量浓度分别在36.00-360.0wmg·L^-1、14.30-143.0wmg·L^-1和13.00-130.0wmg·L^-1内与峰面积呈良好的线性关系,相关系数分别为0.999w7、0.999w9和0.999w8,平均回收率分别为98.9%、98.7%和99.1%（n=9）,RSD分别为1.1%、1.9%和1.4%。结论w本方法简便、准确、重复性良好,可作为新止骨增生丸的质量控制方法之一。

新止骨增生丸基于miR-146a对TGF-β/SMAD信号转导通路下TGF-β1、SMAD4表达的影响及治疗骨性关节炎的作用机制研究

目的利用细胞、分子生物学技术,采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(Real-time PCR,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测方法,观察新止骨增生丸对大鼠膝骨关节炎软骨细胞的作用机制及细胞凋亡的影响,并讨论新止骨增生丸治疗膝骨关节炎的作用机制。方法SPF级6月龄大鼠24只,随机分为两组,空白组6只;模型复制组18只。模型复制组大鼠采用前后交叉韧带离断术复制骨性关节炎大鼠模型,模型复制成功后,将改组大鼠再次随机分为3组:模型组(6只),中药组(6只),西药组(6只)。连续治疗6周后,取整个膝关节,分离软骨组织。膝关节病理切片HE染色法观察各组软骨细胞状态,采用RT-PCR法检测各组大鼠膝关节中miR-146a的表达水平,采用WB法检测各组大鼠膝关节软骨组织中SMAD4和TGF-β1表达,采用SPSS 16.0软件包对RT-PCR法和WB法检测结果进行方差分析,P<0.05有统计学意义。结果(1)膝关节病理切片结果:经新止骨增生丸治疗后KOA症状减轻。(2)RT-PCR检测结果:模型组较空白组的miR-146a表达明显上调(P<0.05);中药组较模型组的miR-146a表达明显上调(P<0.05);西药组较模型组对比无统计学意义(P>0.05)。(3)WB检测结果:模型组较空白组的SMAD4、TGF-β1表达水平明显上调(P<0.05);中药组较模型组SMAD4、TGF-β1蛋白表达水平均呈现明显上调趋势(P<0.05)。结论新止骨增生丸能够通过miR-146a对TGF-β/SMAD信号通路的调控,达到治疗膝骨性关节炎的效果。

新止骨增生丸对膝骨关节炎软骨细胞JAK-STAT信号通路下JAK2、P-JAK2表达及SOCS1负反馈影响

目的观察新止骨增生丸含药血清对软骨细胞JAK-STAT信号通路相关调节因子的影响,探讨新止骨增生丸对骨关节炎的作用机制。方法C28/I2细胞系建立体外软骨细胞退变模型,分别采用空白血清、新止骨增生丸含药血清、抑制剂血清、抑制剂+含药血清干预24 h后,收集软骨细胞,采用ELISA检测软骨细胞分泌肿瘤细胞坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-6)能力的影响,Westernblot法检测JAK2、SOCS1蛋白表达水平变化,Westernblot法检测各组软骨细胞中JAK2的磷酸化水平。结果与模型组相比,ELISA结果表明新止骨增生丸含药血清可有效降低炎性因子TNF-α和IL-6含量(P<0.05);Westernblot结果与ELISA结果趋势一致,即新止骨增生丸含药血清能抑制JAK2蛋白表达(P<0.05)。SOCS1负反馈调节蛋白表达升高。结论新止骨增生丸可通过调控JAK-STAT信号通路,抑制骨关节炎炎症反应,从而起到治疗骨关节炎作用。

新止骨增生丸对膝骨关节炎软骨细胞JAK/STAT信号通路下STAT3、P-STAT3表达影响及作用机制研究

目的探讨新止骨增生丸干预膝骨关节炎的机制研究。方法人软骨细胞株c28/i2稳定传代后并用白介素-1β(IL-1β)干预制备膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)模型软骨细胞。将细胞分为Con组(正常c28/i2细胞+空白血清)、Mod组(KOA模型c28/i2细胞+空白血清)、XZG组(KOA模型c28/i2细胞+10%新止骨增生丸家兔血清)、Cer组(KOA模型c28/i2细胞+32 nm/L Cerdulatinib)、Cer+XZG组(KOA模型c28/i2细胞+10%新止骨增生丸家兔血清+32 nm/L Cerdulatinib);CCK-8试剂盒检测Mod组细胞和不同浓度新止骨增生丸血清干预的XZG组细胞的增殖活性;酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测各组细胞培养上清液中血小板衍生因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的含量;蛋白质印迹法(Western-blot)检测各组细胞中信号转导和转录激活子3(STAT3)的磷酸化水平及增殖细胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen,PCNA)、STAT3蛋白表达水平;采用SPSS16.0软件对各组数据进行分析,以x—±s表示各组实验结果,多组间比较采用单因素方差分析。结果与Con组比较,Mod组细胞的酪氨酸蛋白激酶/信号转导子和转录激活子(janus activated kinase signal transducer/activator of transcription,JAK/STAT)信号通路明显活化,STAT3蛋白的磷酸化水平及STAT3蛋白表达显著升高。新止骨增生丸含药血清可明显抑制上述因子的磷酸化发生,与Cer组及Cer+XZG组联合比较分析,新止骨增生丸含药血清可能是通过抑制JAK/STAT信号通路而实现其对膝骨关节炎的治疗作用。结论新止骨增生丸含药血清通过抑制JAK/STAT信号通路而实现其对膝骨关节炎的治疗作用。

新止骨增生丸与薰洗方熏蒸联合膝关节镜清理术治疗早中期膝关节骨性关节炎46例临床观察

[目的]观察新止骨增生丸与薰洗方熏蒸联合膝关节镜清理术治疗膝关节骨性关节炎疗效。[方法]使用前瞻性设计方法,将46例患者行膝关节镜清理术,术后1周患膝关节腔内注射透明质酸钠2mL,1次/周,4周为1个疗程。术后第二天开始,新止骨增生丸（辽宁中医药大学附属医院骨伤二科协定方,熟地黄、骨碎补、肉苁蓉、鸡血藤、牛膝等）,1剂/d,水煎300mL,早晚温服,7d为1个疗程,连续6个疗程。术后切口愈合拆线后1周开始,患膝薰洗方（辽宁中医药大学附属医院骨伤二科协定方,熟地黄、附子、威灵仙、桂枝、杜仲、枸杞子、鹿角、菟丝子、山茱萸、当归、牛膝等）熏蒸治疗,将上述中药装袋,放入薰洗方熏蒸多功能治疗机中,加水1.5∽2L煎煮,待药液煮沸后,将患者膝部置于熏蒸治疗机上进行熏蒸,根据患者的耐受程度调整熏蒸治疗机的温度,25min/次,2次/d,7d为1个疗程,连续3疗程。观测临床症状、不良反应。注射透明质酸钠治疗1疗程（4周）,新止骨增生丸连续治疗6疗程（42d）,薰洗方熏蒸治疗3疗程（21d）,判定疗效。[结果]临床控制6例,显效15例,有效23例,无效2例,总有效率95.65%[结论]新止骨增生丸与薰洗方熏蒸联合膝关节镜清理术治疗膝关节骨性关节炎疗效显著,值得推广。