携带新城疫病毒DNA疫苗的鼠伤寒沙门氏菌及其安全性与免疫效力

根据GenBank中发表的新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS5F基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,获得重组真核表达质粒pVAX1F。将pVAX1F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1F)。重组菌以不同剂量口服免疫1日龄雏鸡,结果表明,细菌对雏鸡具有良好的安全性,且不影响鸡的增重。将SL7207(pVAX1F)分别以108CFU和109CFU的剂量3次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,抗体检测结果显示,在三免后1周,SL7207(pVAX1F)109CFU剂量组的血清抗体效价与空载体组之间存在显著性差异(p<0.05)。重组菌两个剂量组在首免后2周开始出现粘膜抗体,并于二免后2周和3周达到较高水平。免疫保护试验结果显示,SL7207(pVAX1F)109CFU剂量组的保护率为77.27%,与空载体组之间存在显著性差异(p<0.05)。

稳定携带新城疫病毒DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-F中扩增出新城疫病毒JS5株的融合蛋白(F)基因,将其克隆入真核表达质粒pmcDNA3.1+中,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-F。通过电穿孔转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pmcDNA3.1-F)。体内、体外试验结果表明,重组质粒pmcDNA3.1-F在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-F。将重组菌SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)分别以1×109CFU剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可产生针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和黏膜抗体。重组菌以5×109CFU剂量两次口服免疫4日龄SPF鸡,免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体和小肠黏膜抗体效价水平与空载体组之间存在显著性差异(P<0.05)。免疫保护试验结果显示,SL7207(pmcDNA3.1-F)和SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组的免疫保护率均与空载体组之间存在显著性差异(P<0.05),且SL7207(pmcDNA3.1-F)免疫组的保护率较SL7207(pcDNA3.1-F)免疫组提高了20.0%,说明稳定携带新城疫病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌具有良好的免疫原性和免疫保护性。

鸡新城疫口服DNA疫苗的安全性、稳定性与免疫效力

将含新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株融合蛋白 (F)基因的真核表达质粒pcDNA3 F的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株 (ZJ111 pcDAN3 F)口服接种小鼠和雏鸡。结果表明 :利用该减毒株作为载体传递DNA疫苗具有相对安全性。用酶切和PCR鉴定法证实在体内外无抗生素存在的条件下重组质粒在受体菌ZJ111菌株内比较稳定。ZJ111 pc DAN3 F以每羽 10 8cfu免疫雏鸡 ,2周后二免 ,二免后 4周攻击致死剂量的强毒株F4 8E9,观察其免疫效力。结果表明 :重组ZJ111 pcDNA3 F菌株不仅能诱导雏鸡产生抗NDV抗体 ,而且能诱导法氏囊B淋巴细胞和胸腺T淋巴细胞的增殖反应 ,对强毒株攻击的保护率为 6 6 7% ,高于pcDNA3 F裸质粒DNA疫苗注射免疫组 (5 0 % )。上述结果初步提示减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性 ,为研制低成本、实用化的口服禽类DNA疫苗奠定了基础。

携带新城疫病毒F基因DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建及其免疫原性

根据GenBank中发表的新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因序列,设计1对引物,通过RT-PCR扩增出鹅源NDV分离株JS5F基因(约1700bp),测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,获得重组真核表达质粒pVAX1-F。pVAX1-F经脂质体转染COS-7细胞,间接免疫荧光试验检测出F基因在COS-7细胞中的表达产物。将pVAX1-F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-F)。重组菌以109CFU/只的剂量2次免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对NDVF蛋白的血清抗体和小肠粘膜抗体应答,SL7207(pVAX1-F)免疫组抗体水平显著高于SL7207(pVAX1)组(P<0.05)。将SL7207(pVAX1-F)以109CFU/只剂量口服免疫1日龄雏鸡,免疫保护试验结果显示,SL7207(pVAX1-F)免疫组对鸡具有良好的保护率(77.27%),与空白对照组和SL7207(pVAX1)空载体组之间存在显著性差异(P<0.05)。结果表明,该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能成功释放所携带的质粒,并能刺激机体产生免疫应答,可对NDV强毒攻击提供良好的免疫保护作用,提示该疫苗候选株对新城疫的控制有重要应用前景。

不同新城疫弱毒苗对新城疫病毒强毒的免疫保护试验

用NDV的LaSota株、VG/GA 株、VH 株、PHY LMV 42株及Clone 30株弱毒疫苗免疫SPF鸡后 ,通过对雏鸡免疫后的血清抗体监测表明 ,4种弱毒疫苗激发雏鸡的抗新城疫病毒抗体滴度在 7log2水平以下 ,且差异不显著。通过以上 4种新城疫弱毒疫苗对新城疫病毒东台强毒株的免疫保护试验表明 :至少单独使用弱毒疫苗 ,不能对东台地区流行的新城疫病毒强毒株提供有效保护 ,保护率在 60 %～ 74%

免疫途径对雏鸡分泌型免疫球蛋白A细胞分布的影响

通过饮水、滴鼻和肌肉注射用鸡新城疫弱毒苗免疫雏鸡，以葡萄球菌Ａ蛋白－辣根过氧化酶（ＳＰＡ－ＨＲＰ）和兔抗鸡分泌型免疫球蛋白Ａ（ＳＩｇＡ）间接组化染色，显示消化道相关淋巴组织（ＧＡＬＴ）和呼吸道相关淋巴组织（ＲＡＬＴ）中ＳＩｇＡ细胞的生成和分布。结果表明：滴鼻和饮水免疫组雏鸡ＧＡＬＴ和ＲＡＬＴ中产生ＳＩｇＡ细胞较早、较多，并于首免后２４ｄ和３０ｄ达到最高峰；肌肉注射组雏鸡ＳＩｇＡ细胞在各相应部位仅零星存在，其数量在整个免疫期间变化不显著。作者还对３种免疫途径与粘膜免疫过程中ＳＩｇＡ细胞的产生、分布。

表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌的构建及其生物学特性分析

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌,并分析其生物学特性。本研究扩增了NDVHN和IBDVVP2主要抗原基因片段,通过重叠延伸PCR扩增获得HN-VP2融合基因,构建重组质粒pYA-HN-VP2,将该重组质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd中,获得表达HN-VP2融合蛋白的减毒重组菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2),并分析其生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性。Westernblot结果显示,重组减毒沙门菌可分泌表达HN-VP2融合蛋白,大小为84ku,且该融合蛋白分别能与相应特异性阳性血清发生反应;生物学特性结果显示,重组菌株失去了利用麦芽糖、山梨醇及乳糖等碳源的能力,其生长速度显著慢于野生菌株SL1344;毒力较野生菌株至少下降5个对数单位,且能够稳定遗传重组质粒pYA-HN-VP2。本研究为鸡新城疫-传染性法氏囊病-沙门菌病的三联口服疫苗研制奠定重要基础。

国内外常用新城疫活疫苗的毒力和血凝滴度测定试验报告

本试验通过对国内外常用新城疫弱毒疫苗最小致死量(MLD)测定、鸡胚平均致死时间(MDT)测定,对疫苗的毒力强弱和致病型进行分析.对疫苗的血凝试验(HA)滴度进行测定,根据疫苗的抗原含量推断免疫效力.测定新城疫不同毒株的弱毒疫苗单苗和与传染性支气管炎H120等的二联苗或三联苗共14种,对其中9种疫苗进行了鸡胚最小致死量(MLD)测定和鸡胚平均致死时间(MDT)试验,对所有的疫苗都进行了HA试验.不管是进口疫苗还是国产疫苗其MDT有较大的差异,其毒力有强有弱,有的为中发型(中等毒力)疫苗,主要是温和型(低毒力)疫苗,最小致死量(MLD)范围为10-8～10-10/0.1ml.不同厂家生产的疫苗HA滴度有较大的区别.国产疫苗的质量与进口疫苗无明显的差异,有的比进口疫苗质量还好.对出口养禽企业选用低毒力、HA滴度高的疫苗具有较好的指导作用.

养殖生产中鸡新城疫常用疫苗及免疫特性

鸡新城疫自1926年首次发现,几乎世界各国都有本病流行的报告。新城疫是鸡病中危害最严重的一种,死亡率极高,强毒力毒株引起的感染常达100%。目前该病主要以疫苗预防为主,介绍新城疫疫苗种类及各类疫苗使用特点,为鸡场免疫及疫苗选择提供一定的参考。

鸡新城疫V_4弱毒湿苗特性及应用效果研究

本文对鸡新城疫V4 弱毒湿苗的特性及应用效果进行了研究。结果表明 ,V4 弱毒湿苗具有良好的安全性 ,免疫原性和耐热性 ,在 2 2～ 30℃环境下保存 6 0天 ,其活性与效价不变 。

鸽新城疫油佐剂灭活苗的研制与应用

利用当地分离的鸽新城疫病毒研制出鸽新城疫油佐剂灭活苗,疫苗接种试验鸽无不良反应,实验室小批试验免疫后20 d抗体水平达到高峰,强毒攻击的保护率为100%,抗体水平在5 log2以上可维持120 d以上,表明初步研制的鸽新城疫病毒油佐剂灭活苗可使鸽产生较高水平的抗体,有较长的免疫持续期。为保证疫苗免疫持续期达到6个月以上和油佐剂灭活苗的稳定性,工厂化生产中增加了疫苗中的抗原含量,同时改进了制苗工艺。35日龄的童鸽,按照传统习惯在断乳后仅免疫一次,鸽群免疫后180 d抗体水平仍然在7 log2以上。大量的田间试用,效果理想,对鸽新城疫的防制起到了免疫预防的作用。

新城疫的合理免疫及常见疫苗使用误区

新城疫是由新城疫病毒引起的危害多种家禽特别是陆生禽类的最主要的传染病之一,疫苗免疫接种是目前国内预防该病的主要防疫手段。试验研究及临床实践结果表明,使用与流行株基因型匹配的疫苗株,并采用新城疫活疫苗配合灭活疫苗的免疫方式,可起到体液免疫及细胞免疫的双重作用,其中黏膜免疫在预防新城疫中也发挥重要作用。笔者在长期基层养殖技术服务中发现,很多养殖场在新城疫疫苗的使用方案、方法及免疫程序等方面存在一些误区,严重干扰了疫苗发挥作用,从而造成临床新城疫的发病。

番茄青枯病植物疫苗胶悬剂保存特性的研究

采用50 L全自动发酵罐进行植物疫苗生产菌株FJA T-1458发酵液制备，将其制成琼脂终浓度为2‰的胶悬剂，研究pH、氯化钠浓度对植物疫苗胶悬剂保存特性的影响，并跟踪检测植物疫苗胶悬剂保存过程致病性及防效的变化。结果表明，植物疫苗胶悬剂保存的最适盐浓度为2％～3％，最适pH值为6～8。植物疫苗胶悬剂保存过程中，菌株对番茄青枯病的防效稳定不变，菌体的致病性指标-弱化指数变化小，从生物学特性可视为变化无差异。

新城疫弱毒联苗对雏鸡新城疫免疫效果的观察

本试验雏鸡在相同饲养管理条件下,14日龄时分别用N79单苗、N79 H120联苗、N79 IBD(三价)联苗接种对照组(ND)、ND+IB组、ND+IBD组试验雏鸡,接种后的第7天、14天和21天,通过HA和HI实验,随机抽样测定其血中抗新城疫抗体的含量及其消长,发现N79 H120联苗、N79 IBD(三价)联苗产生的抗鸡新城疫的抗体效价明显低于N79单苗,差异极显著(P<0 01)。

携带NDV HN 基因的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统构建及其生物学特性分析

为构建能稳定携带新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(Hemagglutinin‑neuraminidase protein,HN)基因的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统,从pMD18-T-HN中扩增出NDV HN基因,并将其克隆入载体pYA3493-sopENt100,构建重组载体pYA3493-sopENt100-HN,然后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,并对其重组菌的生长特性、遗传稳定性、表达特性和毒力特性等进行分析。结果显示,携带NDV HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-sopENt100-HN)构建成功;重组菌ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-sopENt100-HN)的生长趋势与互补菌ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-sopENt100)和缺失菌ΔcrpΔasd SL1344相似,与亲本菌株SL1344有明显差异;重组菌能够稳定表达HN基因;减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统能够有效递呈HN基因,并诱导其在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)内表达;重组菌的LD_(50)与互补菌和缺失菌没有明显差异,与亲本菌株SL1344差异较大。以上结果表明,成功构建了携带NDV HN基因的新型减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-sopENt100-HN),能够有效递呈NDV HN基因并使其高效表达,且安全性高,遗传稳定。

经鸡胚感染的ALV-J对新城疫弱毒疫苗免疫的抑制作用及疫苗株对病毒载量的影响

为了解经鸡胚感染携带J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的雏鸡体内ALV-J对新城疫(ND)弱毒疫苗(La Sota株)免疫的抑制作用以及疫苗免疫后增强ALV-J对雏鸡致病作用的可能性,随机选择50个SPF鸡胚经卵黄囊接种模拟ALV-J感染,同时选取等量SPF鸡胚以相同方式接种PBS作为对照。出雏后于接毒组和对照组各取20只SPF鸡在7日龄时免疫ND弱毒疫苗(La Sota株)。2~6周龄时,记录各组鸡的体重和免疫器官指数,并对雏鸡的NDV抗体水平和血液ALV-J病毒载量进行动态检测。结果显示,感染ALV-J的SPF鸡5、6周龄时体重显著低于PBS对照组(P<0.05),而感染ALV-J再免疫新城疫弱毒疫苗后SPF鸡体重进一步降低(P>0.05);与PBS对照组相比,6周龄时感染ALV-J的SPF雏鸡胸腺萎缩和脾脏肿大(P>0.05),免疫新城疫弱毒疫苗后胸腺和脾脏损伤加剧(P<0.05);3、4周龄时感染ALV-J再免疫ND弱毒疫苗组的雏鸡NDV抗体水平极显著低于仅免疫ND弱毒疫苗组(P<0.01);4周龄时免疫弱毒疫苗后的SPF鸡血液中ALV-J病毒载量高于未免疫组(P<0.01)。研究表明,感染ALV-J的雏鸡在免疫ND弱毒疫苗(La Sota株)后增强了ALV-J对SPF雏鸡的致病作用,提示净化种源的重要性。

泰山梧桐花多糖对免疫抑制小鼠的免疫调理作用

采用5种不同剂量的环磷酰胺(CTX)皮下注射小鼠,筛选能造成显著免疫抑制的CTX最佳剂量,建立小鼠免疫抑制模型。通过水提醇沉法提取泰山梧桐花多糖,将不同剂量的泰山梧桐花多糖加入到新城疫活疫苗中,制备含泰山梧桐花多糖的新城疫弱毒苗,注射免疫抑制小鼠,来探讨泰山梧桐花多糖对免疫抑制小鼠的免疫调理作用。结果显示,泰山梧桐花多糖能提高免疫抑制小鼠的抗体水平、淋巴细胞比率、淋巴细胞数及血液淋巴细胞转化率,其中400mg/L剂量组(I组)可在第3天解除CTX导致的小鼠免疫抑制;由此说明泰山梧桐花多糖对小鼠具有免疫增强作用。该研究为泰山梧桐花多糖开发成为免疫增强剂和免疫佐剂提供了理论依据。