应用Dot－ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究

报道了斑点免疫吸附ＥＬＩＳＡ（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）快速检测草鱼出血病病毒（ＧＣＨＶ）的方法以及对提纯病毒、染毒细胞内病毒和病鱼组织的检测结果，并对该方法的灵敏度与ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法进行了系统的比较。结果表明，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检出ＧＣＨＶ的最低含量为３ｐｇ，该灵敏度比ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法分别提高１０倍和２０倍，而且快速易行，是目前检测ＧＣＨＶ最为有效的方法，并可在草鱼出血病临床诊断和病毒疫苗质量鉴定等方面得到应用。

Dot-ELISA间接法检测鸡新城疫病毒(NDV)的研究

常规方法分离纯化鸡ＩｇＧ，免疫羊制备羊抗鸡ＩｇＧ二抗，以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记制备酶标记物的工作浓度为１：１０００；选用硝酸纤维素（ＮＣ）膜作固相载体，建立检测ＮＤＶ抗原的斑点间接酶联免疫吸附试验诊断方法。检测ＮＤＶ鸡胚毒４０份，阳性检出率１００％；人工感染非免疫鸡的气管组织、肺组织各４７份，检出率为９３．６％；人工感染ＳＰＦ鸡气管组织、肺组织各４０份，检出率１００％。与传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、减蛋综合症病毒（ＥＤＳＶ）、传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）无交叉反应。试验显示该方法简便、特异、快速、结果直观。

Dot-ELISA检测减蛋综合征病毒的研究

将辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）直接标记到ＭｃＡｂ（ＩｇＧ）上，建立了检测减蛋综合征（ＥＤＳ７６）病毒的ＤｏｔＥＬＩＳＡ方法，可敏感、特异、及早、快速地检测细胞培养物和实验感染鸡样品中的病毒抗原，某发病鸡场的泄殖腔拭子样品的阳性率为４３３３％（１３／３０）。

应用RT-PCR和dot-ELISA方法检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒

本文比较了RT-PCR和dot-ELISA两种方法对单头灰飞虱携带水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）的检出率、检测灵敏度和检测成本。结果表明,两种方法均能检测到单头灰飞虱体内的RSV,RT-PCR检测单头灰飞虱体内RSV的阳性检出率比dot-ELISA方法低11.79%-15.77%,但RT-PCR的检测灵敏度比dot-ELISA高10倍,RT-PCR技术的检测成本比dot-ELISA的高。结果暗示,对于单头介体昆虫中的病毒检测,RT-PCR技术的检出率不一定比dot-ELISA的高。综合考虑后,如对室外大批量灰飞虱进行带毒率检测时可采用dot-ELISA方法,如需准确分析单头灰飞虱体内RSV时可采用RT-PCR方法。

重庆丰都烟区田间烟草病毒病及其Dot-ELISA检测

为明确重庆市丰都烟区田间烟草病毒病的发生情况,开展了病毒病调查,并于还苗期、伸根期、旺长期和成熟期共采集病毒病样品117 份,利用TMV、CMV、PVY、TEV、PVX、TuMV 和BBWV-2 等7 种病毒的特异性抗体对其进行Dot-ELISA检测.调查发现,病毒病症状主要包括花叶、畸形、坏死斑、脉坏死、矮化和蚀纹等类型.9 个调查点烟草病毒病的发病率在28%～84%,病情指数最低为6.67,最高为60.89.Dot-ELISA 检测结果表明,还苗期样品未检出病毒;伸根期没有检测到PVX;旺长期和成熟期均检测到7 种病毒,其中TMV 和CMV 的检出率较高,其次为TuMV 和PVY,PVX 的检出率较低.此结果表明,烟草病毒病在丰都烟区发生较普遍,且TMV 和CMV 为田间烟草病毒病的优势毒源.

Dot-ELISA检测H9亚型禽流感病毒的研究

本研究采用兔抗H9亚型禽流感病毒(AIV)IgG包被于硝酸纤维素膜,酶标羊抗兔IgG作二抗,建立检测H9亚型AIV的Dot-ELISA法。经方阵试验确定兔抗AIVIgG工作浓度为1∶400,酶标羊抗兔IgG的工作浓度为1∶400。作者建立的Dot-ELISA对AIV的最小检测量为3.35×10-9g。Dot-ELISA与HA和HI、AGP及病毒分离法相比,检测63份临床疑似H9亚型AIV病料,Dot-ELISA检出32份(57.14%),HA和HI检出15份(23.81%),AGP检出11份(17.46%),病毒分离检出38份(60.30%)。用抗H9亚型AIV阳性血清可以阻断Dot-ELISA阳性反应,诊断膜片与鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合征病毒不出现阳性反应,证明Dot-ELISA特异性好。分别置室温(25℃左右)、4℃和-20℃下保存1个月后,膜片诊断效果不变,对照反应均成立,该方法重复性好(重复符合率为93.9%),操作简便(3 h内可完成),不需要特殊检测仪器,结果客观,肉眼易于判断,是微生物和传染病及寄生虫病诊断标准化的新技术之一。

凤台县主要蔬菜病毒的dot-ELISA检测研究

利用dot-ELISA法检测了安徽省凤台县蔬菜产区茄科、葫芦科和豆科蔬菜中5种主要病毒(TSWV、TMV、CMV、CGMMV和BBWV)的带毒率,检测结果发现,5种病毒的带毒率分别为1.52%、13.64%、31.89%、54.32%和20.39%。CMV与CGMMV和BBWV分别存在复合侵染现象,复合侵染率分别为29.63%和50.00%。另外,辣椒、瓜类和豇豆带毒率较高,菜豆未检出病毒。本研究结果可为凤台县蔬菜主要病毒病的综合防治提供重要的理论依据。

应用Dot－ELISA快速检测传染性法氏囊病病毒

本文成功建立了斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ），应用于传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）的快速检测。该方法操作简便快速、特异性好、灵敏度高。同时对深圳某鸡场发生ＩＢＤ病料进行了病毒分离，用Ｄｏｒ－ＥＬＩＳＡ检测接种鸡胚的绒毛尿囊膜裂解上清呈强阳性反应。

单抗夹心ELISA检测免疫鸡群新城疫病毒

用SPF鸡胚将送检的免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代,再用新城疫单抗夹心ELISA对F1代尿囊液进行新城疫病毒(NDV)快速检测,同时用世界动物卫生组织(OIE)推荐的NDV分离及鉴定的方法加以验证。通过对3423份样品的检测,检出阳性样品453份,阴性样品2959份,可疑样品11份,两种方法的阳性符合率为99.3%,阴性符合率为99.7%。对全部阳性样品进行病毒分离,经血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验证明均含有新城疫病毒(NDV),再将全部阳性样品分离物进一步作毒力鉴定,结果有强毒力株、中等毒力株及弱毒力株,因此用新城疫单抗夹心ELISA检测免疫鸡群泄殖腔棉拭样品F1代尿囊液新城疫病毒快速、准确率高,呈阳性者不全是NDV强毒力株感染,还有NDV中等毒力株或弱毒力株感染。

用单抗夹心ELISA快速检测鸡新城疫病毒

采用传统的病毒分离的方法将免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代 ,再用新城疫单抗夹心ELISA对F1 尿囊液进行新城疫病毒 (NDV)检测。结果表明本方法具有良好的特异性 ,NDV阳性样品检出率很高 ,且鸡禽流感病毒 (AIV)对此无干扰作用 ;分别检测阳性样品 4 5 3份、阴性样品 2 95 9份 ,与动物世界卫生组织 (OIE)推荐的病毒分离及鉴定、毒力试验的经典检测方法相比较 ,符合率为 99.3%、99.7% ;测定的变异系数为 8% ,稳定性较好 ,同时本法比经典的检测方法缩短检测时间 7d。结果表明用单抗夹心ELISA法检测鸡泄殖腔棉拭样品F1 尿囊液新城疫病毒实用、准确、特异、稳定、快速。

四川省攀西地区南瓜、甜菜和辣椒部分病毒种类的ELISA检测

利用马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)的多克隆抗体,以及烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV-2)及芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的单克隆抗体,采用抗原直接包被ELISA法对四川省攀枝花、西昌和德昌地区的南瓜、甜菜和辣椒上采集的病毒病样品进行了检测。结果表明,在87份样品中PVY的侵染最普遍,总检出率达74.71%;CMV、TMV、TuMV、BBWV-2和PVX的总检出率分别为12.64%、13.79%、22.99%、10.34%和14.94%。在87份样品中,仅发现TuMV、PVX及PVY的单独侵染;其余25份样品均检测到2种以上病毒的复合侵染,总检出率为34.72%。表明攀西地区蔬菜上病毒复合侵染现象普遍,PVY是该地区蔬菜上的优势毒原。

应用聚乙二醇介导的单抗夹心ELISA监测湖南新城疫病毒强毒感染

采用新城疫病毒强毒快速检测法聚乙二醇介导的单抗夹心酶联免疫吸附测定 ( EL ISA)对湖南省新城疫病毒 ( NDV)强毒感染进行了监测 ,共检测来自 3 0个新城疫发病群和 2 8个无明显新城疫病症群共 5 8个禽群的泄殖腔棉拭样品 1719份 ,并对 97份样品进行了病毒分离鉴定 .结果表明 ,NDV强毒感染的禽种多 ,易与其他疫病混合感染 ,免疫鸡群在发生形式上呈非典型化趋势 ,养禽场普遍存在 NDV强毒且临诊健康群有一定比例的强毒感染率 ,这些是目前 ND难以控制和净化的主要原因 .结果还表明 ,所采用的 EL ISA是监测

新城疫病毒融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

用新城疫病毒(NDV)F48E8株作为包被抗原,建立了检测由鸡痘病毒载体介导表达的NDV融合蛋白(F)抗体的间接ELISA方法。通过对20份阳性血清的P/N值与ELISA抗体效价(ET)的自然对数值(lnET)的线性回归分析,获得了回归方程lnET=0.201×P/N+4.632。应用该ELISA方法对表达NDVF基因的重组鸡痘病毒免疫鸡群进行了血清抗体检测,结果表明,血清的ELISA抗体效价与相应血清中和试验的抗体效价高度相关。攻毒保护试验的结果显示,ELISA抗体效价与机体的保护力表现一定程度的相关性。

天津地区番茄病毒病发生情况调查及其毒源ELISA检测

对采自天津5个区县的255份番茄样品进行了双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)检测。检测结果表明,在这255份样品中,至少217份感染了所检测病毒,其中,感染番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,To MV)、蚕豆萎蔫病毒1、2号(Broad bean wilt virus 1、2,BBWV-1、2)、番茄斑萎病毒(TSWV)的样品分别为53.33%,53.33%,20.39%,14.12%,9.41%,0.39%。在检测呈阳性的217份样品中病毒单独侵染率为32.15%,复合侵染率为52.94%,这些数据表明在番茄上病毒复合侵染现象相当严重,其中受2种病毒复合侵染率高达40.39%,而受3种病毒复合侵染率达12.55%。

ABC-ELISA检测鸡新城疫病毒

建立了检测鸡新城疫病毒的ABC-ELISA方法。应用此法测定了Lasota株、Mukt-eswar株和细胞培养的新城疫强毒的效价,结果较满意。比较试验证明,ABC-ELISA的敏感性比常规ELISA高2～16倍,比HA法高4～64倍。检测感染鸡口腔和泄殖腔棉拭材料,检出率分别为83.3％和100％,比常规ELISA分别提高33.3％和16.7％,而HA则检不出。该法特异性好,能被特异性抗体和亲和素所阻断,对传染性支气管炎病毒、鸡痘病毒、鸭瘟病毒均不发生交叉反应。重复性亦好,同一样本先后经多次测定,结果基本一致。

鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用

为快速检测鸡传染性法氏囊病毒,使用纯化的鸡抗IBDV多克隆抗体和鼠抗IBDV单克隆抗体,建立了抗原捕获ELISA检测鸡传染性法氏囊病毒的方法。使用建立的方法可以检测到1∶160倍稀释的IBDV疫苗及阳性法氏囊组织中的病毒。检测禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎病毒及沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌等结果均为阴性。检测IBDV超强毒和疫苗毒人工感染鸡的法氏囊、脾、肝及临床样品78份,检出阳性24份,与RT-PCR检测结果相符率为96%(75/78)。说明建立的方法敏感、特异,可用于法氏囊病的诊断和监测。

间接ELISA法检测鸡新城疫抗体

应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的新城疫病毒(NDV),经tritonX100处理并反复冻融制备新城疫ELISA抗原。应用抗鸡Ig轻链单抗1B7辣根过氧化物酶结合物建立了定量检测NDV抗体水平的ELISA方法。确立了将鸡血清100倍稀释检测ELISA效价(ET)的回归方程y=0.94128x+0.20677,r=0.98163,可用于定量测定。血凝抑制(HI)方法与ELISA方法的比较试验表明,ELISA法的敏感性是HI方法的3倍以上。应用建立的ELISA方法比较了卵黄、气管及胆汁中局部抗体与血清抗体的差异。

单克隆抗体夹心ELISA试验检测鸡新城疫病毒抗原的研究

从10株抗鸡新城疫病毒(NDV)特异性单克隆抗体(MAbs) 中筛选出2株MAbs—M22和F23,分别用作包被抗体和酶标抗体而建立的MAbs—夹心ELISA试验,对提纯NDV的最小检出量为25ng/ml病毒蛋白.NDV鸡阳性血清对本试验的特异性阻断作用和与其他禽类病毒交叉反应的阴性结果,证明本试验对NDV的特异性。从临床疑为鸡新城疫的724只病鸡的口腔棉试样品中共检出阳性502只,其中200个样品与病毒分离试验结果完全一致,两者均查出阳性鸡176只。

新城疫病毒HN基因的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种快速的新城疫病毒(NDV)抗体检测方法,参照已发表的NDV基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约1044bp的HN基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。该方法批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92.0%、91.0%和93.6%。

鹅源新城疫病毒F基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

参照GenBank公布的鹅源新城疫病毒NA-1株F基因(DQ659677)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增F基因全长,将其克隆到pET-22b(+)载体中,构建了原核表达载体pET-22b(+)-F,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化了重组蛋白,Western-blot证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为0.21μg/孔,建立了检测鹅源新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。