单抗夹心ELISA检测免疫鸡群新城疫病毒

用SPF鸡胚将送检的免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代,再用新城疫单抗夹心ELISA对F1代尿囊液进行新城疫病毒(NDV)快速检测,同时用世界动物卫生组织(OIE)推荐的NDV分离及鉴定的方法加以验证。通过对3423份样品的检测,检出阳性样品453份,阴性样品2959份,可疑样品11份,两种方法的阳性符合率为99.3%,阴性符合率为99.7%。对全部阳性样品进行病毒分离,经血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验证明均含有新城疫病毒(NDV),再将全部阳性样品分离物进一步作毒力鉴定,结果有强毒力株、中等毒力株及弱毒力株,因此用新城疫单抗夹心ELISA检测免疫鸡群泄殖腔棉拭样品F1代尿囊液新城疫病毒快速、准确率高,呈阳性者不全是NDV强毒力株感染,还有NDV中等毒力株或弱毒力株感染。

用单抗夹心ELISA快速检测鸡新城疫病毒

采用传统的病毒分离的方法将免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代 ,再用新城疫单抗夹心ELISA对F1 尿囊液进行新城疫病毒 (NDV)检测。结果表明本方法具有良好的特异性 ,NDV阳性样品检出率很高 ,且鸡禽流感病毒 (AIV)对此无干扰作用 ;分别检测阳性样品 4 5 3份、阴性样品 2 95 9份 ,与动物世界卫生组织 (OIE)推荐的病毒分离及鉴定、毒力试验的经典检测方法相比较 ,符合率为 99.3%、99.7% ;测定的变异系数为 8% ,稳定性较好 ,同时本法比经典的检测方法缩短检测时间 7d。结果表明用单抗夹心ELISA法检测鸡泄殖腔棉拭样品F1 尿囊液新城疫病毒实用、准确、特异、稳定、快速。

应用聚乙二醇介导的单抗夹心ELISA监测湖南新城疫病毒强毒感染

采用新城疫病毒强毒快速检测法聚乙二醇介导的单抗夹心酶联免疫吸附测定 ( EL ISA)对湖南省新城疫病毒 ( NDV)强毒感染进行了监测 ,共检测来自 3 0个新城疫发病群和 2 8个无明显新城疫病症群共 5 8个禽群的泄殖腔棉拭样品 1719份 ,并对 97份样品进行了病毒分离鉴定 .结果表明 ,NDV强毒感染的禽种多 ,易与其他疫病混合感染 ,免疫鸡群在发生形式上呈非典型化趋势 ,养禽场普遍存在 NDV强毒且临诊健康群有一定比例的强毒感染率 ,这些是目前 ND难以控制和净化的主要原因 .结果还表明 ,所采用的 EL ISA是监测

ABC-ELISA检测鸡新城疫病毒

建立了检测鸡新城疫病毒的ABC-ELISA方法。应用此法测定了Lasota株、Mukt-eswar株和细胞培养的新城疫强毒的效价,结果较满意。比较试验证明,ABC-ELISA的敏感性比常规ELISA高2～16倍,比HA法高4～64倍。检测感染鸡口腔和泄殖腔棉拭材料,检出率分别为83.3％和100％,比常规ELISA分别提高33.3％和16.7％,而HA则检不出。该法特异性好,能被特异性抗体和亲和素所阻断,对传染性支气管炎病毒、鸡痘病毒、鸭瘟病毒均不发生交叉反应。重复性亦好,同一样本先后经多次测定,结果基本一致。

新城疫病毒融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

用新城疫病毒(NDV)F48E8株作为包被抗原,建立了检测由鸡痘病毒载体介导表达的NDV融合蛋白(F)抗体的间接ELISA方法。通过对20份阳性血清的P/N值与ELISA抗体效价(ET)的自然对数值(lnET)的线性回归分析,获得了回归方程lnET=0.201×P/N+4.632。应用该ELISA方法对表达NDVF基因的重组鸡痘病毒免疫鸡群进行了血清抗体检测,结果表明,血清的ELISA抗体效价与相应血清中和试验的抗体效价高度相关。攻毒保护试验的结果显示,ELISA抗体效价与机体的保护力表现一定程度的相关性。

Dot-ELISA间接法检测鸡新城疫病毒(NDV)的研究

常规方法分离纯化鸡ＩｇＧ，免疫羊制备羊抗鸡ＩｇＧ二抗，以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记制备酶标记物的工作浓度为１：１０００；选用硝酸纤维素（ＮＣ）膜作固相载体，建立检测ＮＤＶ抗原的斑点间接酶联免疫吸附试验诊断方法。检测ＮＤＶ鸡胚毒４０份，阳性检出率１００％；人工感染非免疫鸡的气管组织、肺组织各４７份，检出率为９３．６％；人工感染ＳＰＦ鸡气管组织、肺组织各４０份，检出率１００％。与传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、减蛋综合症病毒（ＥＤＳＶ）、传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）无交叉反应。试验显示该方法简便、特异、快速、结果直观。

间接ELISA法检测鸡新城疫抗体

应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的新城疫病毒(NDV),经tritonX100处理并反复冻融制备新城疫ELISA抗原。应用抗鸡Ig轻链单抗1B7辣根过氧化物酶结合物建立了定量检测NDV抗体水平的ELISA方法。确立了将鸡血清100倍稀释检测ELISA效价(ET)的回归方程y=0.94128x+0.20677,r=0.98163,可用于定量测定。血凝抑制(HI)方法与ELISA方法的比较试验表明,ELISA法的敏感性是HI方法的3倍以上。应用建立的ELISA方法比较了卵黄、气管及胆汁中局部抗体与血清抗体的差异。

单克隆抗体夹心ELISA试验检测鸡新城疫病毒抗原的研究

从10株抗鸡新城疫病毒(NDV)特异性单克隆抗体(MAbs) 中筛选出2株MAbs—M22和F23,分别用作包被抗体和酶标抗体而建立的MAbs—夹心ELISA试验,对提纯NDV的最小检出量为25ng/ml病毒蛋白.NDV鸡阳性血清对本试验的特异性阻断作用和与其他禽类病毒交叉反应的阴性结果,证明本试验对NDV的特异性。从临床疑为鸡新城疫的724只病鸡的口腔棉试样品中共检出阳性502只,其中200个样品与病毒分离试验结果完全一致,两者均查出阳性鸡176只。

新城疫病毒HN基因的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种快速的新城疫病毒(NDV)抗体检测方法,参照已发表的NDV基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约1044bp的HN基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。该方法批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92.0%、91.0%和93.6%。

鹅源新城疫病毒F基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

参照GenBank公布的鹅源新城疫病毒NA-1株F基因(DQ659677)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增F基因全长,将其克隆到pET-22b(+)载体中,构建了原核表达载体pET-22b(+)-F,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化了重组蛋白,Western-blot证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为0.21μg/孔,建立了检测鹅源新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。

固相微球双抗体夹心ELISA法检测NDV抗原

用抗新城疫病毒单克隆抗体FN_(29)和FN_(29)—HRP,分别作为捕捉抗体和示踪抗体,建立了MDS—ELISA法检测NDV抗原.FN_(29)为400μg—IgM时,可检出3μg/ml NDV蛋白.MDS—ELISA敏感性高于DFA,DFA阳性的标本,MDS—ELISA亦阳性,MSD—ELISA阳性的部分标本,DFA为阴性.两者符合率92%.人工感染病鸡的组织中NDV抗原检出率为:盲肠扁桃体、肺和肾混合液100%,肾100%,肺90%,肝、脾和盲肠扁桃体均为80%.鸡接种Ⅰ系弱毒疫苗后6天内,部分鸡肺组织中可检出NDV抗原.鸡接种Ⅱ系弱毒疫苗后,在组织中未能检出NDV抗原.该方法特异性强,灵敏度高,快速、经济、简便,克服了DFA需要特殊仪器的限制,易于基层推广应用.

出口家禽新城疫病毒PCR和ELISA联合检测方法的建立

针对出口家禽新城疫泄殖腔棉拭样品病毒检测的需要，建立了IK2R和ELISA联合检测方法。结果表明：检测时间较常规缩短7～14d；通过被检样品鸡胚传代，提高了阳性检测率；特异性强，只与不同类型新城疫病毒反应，不与其他常见禽类病毒反应；所检的3216个样本，符合率98．8％；用多重RT-IK2R和脑内接种试验两种方法鉴定的114份样品，符合率99．1％；与G朗Bank中部分新城疫病毒F基因比较，同源性81％～100％。

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及其抗原捕捉ELISA方法的建立

为建立一种快速的新城疫病毒病原检测方法。本研究以原核表达的重组HN蛋白免疫7周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了1株能稳定分泌抗新城疫病毒HN蛋白的McAb杂交瘤细胞,命名为4E8,4E8亚类鉴定为重链属于IgG2a,轻链属于κ链。以多克隆抗体作为包被抗体、单克隆抗体4E8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测新城疫病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法对EDSV、ITLV、IBV、IBDV不发生交叉反应,其敏感性比HA试验要高4倍以上,与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为95.6%、93.3%、96.1%。本研究建立的NDVAC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于新城疫病毒感染的早期诊断。

基于新城疫病毒V蛋白鉴别鸡群感染与免疫的间接ELISA方法的建立

本研究以新城疫病毒(NDV)V蛋白羧基端结构域(Vc)的重组蛋白为包被抗原,建立了用于检测NDV V蛋白抗体的间接ELISA方法,并采用该方法检测了鸡群免疫或接毒后血清中的V蛋白抗体水平。结果显示:两组不同NDV灭活疫苗组在免疫后的3周内检测结果均为阴性;两组灭活疫苗免疫3周后再人工感染NDV强毒的鸡群,攻毒后第7、14和21 d,NDV阳性率分别为60%、80%、70%和50%、80%、70%;两组不同的NDV弱毒疫苗免疫组鸡群,仅在免疫后第21 d阳性率分别为20%和10%。以上结果表明,NDV疫苗免疫组与强毒感染组的V蛋白抗体阳性率存在明显差异,本方法可在群体水平上区分新城疫疫苗免疫与强毒感染鸡群,为NDV血清学诊断和流行病学调查提供了一种新的检测手段。

新城疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的初步建立

目的制备新城疫病毒(NDV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(单抗),并用于建立一种可定量检测NDV病毒含量的双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测方法(NDV NP ELISA)。方法基于NDV病毒株F48E9获得NP基因,经原核表达方式制备出重组抗原rNP;免疫小鼠制备NDV NP特异性单抗;单抗经HRP标记和配对筛选,建立NDV NP ELISA,分析其特异性、灵敏度、精密度、准确度和检测线性,并分析本方法定量检测的NP含量与PFU病毒滴度的定量相关性。结果建立基于单抗3C10和4E7的NDV NP ELISA,其定量检测NDV rNP的最佳线性范围为0.015~0.250μg/ml(R2=0.9974),回收率在88.4%~106.01%,变异系数小于3.4%;该方法具有良好特异性;该方法定量检测NDV抗原含量与PFU病毒感染滴度有较好的相关性(R2=0.9209)。结论建立NDV NP ELISA,可准确定量检测NDV病毒中的NP抗原含量,为NDV病毒含量的测定提供一种可靠简便的分析方法。

新城疫病毒HN特异性多肽抗体间接ELISA方法的建立

为建立快速检测新城疫病毒抗体的血清学方法,通过合成NDV主要保护性抗原HN蛋白和F蛋白上的特异性表位多肽,将其与BSA载体蛋白偶联,作为包被抗原,建立检测NDV抗体的间接ELISA方法。并对其进行敏感性、特异性、与HI方法阴阳性符合率检测。结果显示:基于'PDEQDYQIRMAKSSYKPGRFGGKRIQQAILS'多肽的该ELISA方法与其他鸡主要传染病阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性。通过对112份临床鸡血清样品进行检测,该方法的敏感性为94.0%、特异性为100%,与HI方法检测的阴阳性符合率为96.4%。研究表明,建立的ELISA方法对血清中NDV的抗体水平检测具有较高的灵敏度和很好的特异性,可为ND疫苗免疫后抗体水平的检测和监测提供可靠工具。

新城疫病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种快速的新城疫病毒抗体检测方法,本研究以原核表达的重组HN蛋白作为诊断抗原,建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。该方法检测AIV(H9亚型)、IBV、IBDV、EDSV 4种常见禽病病原的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1∶12 800;批内重复性试验、批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;与血凝抑制试验(HI)符合率为96.1%。本研究建立的NDV HN间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为NDV的抗体检测及流行病学调查等快速诊断提供一种技术手段。

上海地区近几年鸭新发病毒性传染病的血清学调查

于2003年从上海市5个区17个养鸭场(户)的鸭群中采集276份血清样品,采用进口ELISA试剂盒对冠状病毒、传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒的感染状况进行了血清学调查。结果表明,受检鸭群存有不同程度的阳性率,原来只感染鸡的疫病逐步向鸭群延伸。

两种甲型肝炎病毒抗原快速检测方法的建立

目的建立两种甲型肝炎病毒抗原(HAV-Ag)检测试剂盒,并对其检测效果进行评价。方法生物素标记甲型肝炎病毒抗体(HAV-Ab)与辣根过氧化物酶标记亲和素联合应用建立甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法;同时使用辣根过氧化物酶标记HAV-Ab作放大系统建立双抗体夹心甲型肝炎病毒抗原ELISA检测试剂,对比两种检测方法的特异性、灵敏度及实际应用效果。结果用生物素标记甲型肝炎病毒抗体-辣根过氧化物酶标记亲和素作放大系统建立的甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法,较双抗体夹心ELISA检测方法灵敏度高1～2个稀释度;两种检测法均对10余种病毒无交叉,P/N值BA-ELISA检测法较高。结论甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法是一种灵敏度高,特异性好,方便快捷的检测方法,可广泛应用于甲型肝炎病毒研究及临床检测中。而甲型肝炎病毒抗原双抗体夹心ELISA检测法,检测灵敏度适中,操作简单,更适用于甲肝疫苗生产检定。

鸡SIgA重链单克隆抗体的制备及新城疫病毒和禽流感病毒特异黏膜SIgA检测方法的建立

为建立快速检测禽类黏膜组织中SIgA含量的方法,本研究原核重组表达鸡SIgA重链片段蛋白,纯化后免疫BALB/c鼠。以鸡胆汁中分离纯化的SIgA作为检测抗原,常规单克隆技术筛选出1株能够稳定分泌抗鸡SIgA单克隆抗体(MAb)的IgG2a、κ型MAb。经ELISA和western blot分析,所获得的1株MAb亲和力高、特异性强;采用生物素标记纯化MAb腹水IgG为检测二抗,以禽流感-新城疫重组二联活载体疫苗免疫SPF鸡为模型,初步建立了新城疫病毒和H5亚型禽流感病毒特异的黏膜SIgA间接ELISA检测方法。本研究为开展特异性家禽黏膜免疫机制的研究提供了重要技术手段。