一种抗体融合蛋白Ni柱亲和层析纯化效果的研究

随着蛋白表达技术的不断发展与优化,发酵液上清中蛋白表达量不断提升,对下游纯化工艺提出了更高的要求,亟需开发高质高效的纯化工艺。Ni亲和层析是一种传统捕获目的蛋白的常用纯化方法。目前市面已有多种Ni亲和层析介质,其配基为螯合剂共价偶联到4%交联的琼脂糖介质上,再螯合Ni2+制备而成,但不同类别的Ni亲和层析介质配基有各自的基质和配位螯合技术,不同蛋白也有自身特性,从而造成介质对目标蛋白亲和力以及洗脱纯度有所差异。针对某抗体药物的纯化工艺探索,比较了3种不同的Ni亲和层析介质动态载量,从上样体积和平衡液咪唑浓度两方面进行该抗体融合蛋白Ni柱纯化条件筛选,并分析纯化后样品SEC纯度、总量、得率。综合考量除杂效果、总量、得率三个因素可知,Ni-IDA 6FF介质最适合该抗体融合蛋白的纯化,且纯化效率最高。

亲和色谱-氢化物发生原子荧光分光光度法纯化检测人血浆中的硒蛋白-P

开发了两步亲和色谱法:肝素-琼脂糖凝胶、Ni-琼脂糖凝胶色谱纯化人血浆中硒蛋白-P的方法,并采用氢化物发生-原子荧光分光光度法(HG-AFS)检测,成功搭建了硒蛋白-P的纯化检测平台。确定了亲和色谱纯化的最佳梯度洗脱条件,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)定性检测,得到了一定纯度的硒蛋白-P,其回收率达43.2%。HG-AFS方法的线性相关系数为0.999 1,检出限为0.09μg/L,日内精密度(RSD)为0.12%,日间精密度(RSD)为0.27%,加标回收率为95%～104%。该亲和色谱纯化方法简单易控、回收率高,HG-AFS检测灵敏度高,结果准确可靠。

一种简便快速工艺制备重组人胸腺肽α_1

将构建的含有胸腺肽α1融合蛋白的编码基因插入表达质粒pET28a(+)中,并在大肠杆菌BL21中进行表达,该菌经IPTG诱导融合蛋白高表达后,离心收集菌体,超声波破碎,包含体裂解,目标蛋白质的体外变性复性后,经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化,每升菌液中可获得260 mg融合蛋白。经重组肠激酶酶切反应、Ni-Sepharose亲和层析,Sephadex G-25柱纯化后,得到了纯度达97%的重组人胸腺肽α1,该纯化工艺简单快速,经三步层析即可得到纯度达97%的重组人胸腺肽α1,且产量达82 mg/L,为大批量用细菌表达重组人胸腺肽α1及纯化提供了参考。

一种耐低温α-乙酰乳酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

从Bacillus subtilis L5-20染色体上克隆得到ALDC基因alsD,构建重组表达载体pMA5-alsD-His,将其转化到B.subtilis WB600中。SDS-PAGE结果显示ALDC在重组B.subtilisWB600中成功表达,其相对分子质量(Mr)为32×103。采用Ni柱亲和层析纯化重组ALDC,所得纯酶的比酶活为272.3 U/mg,总回收率为89.8%。该重组ALDC最适反应温度仅为25℃,在20～35℃范围内均表现出较高的活性。Ni2+对ALDC有一定的激活作用,Fe3+使ALDC活性完全丧失。经摇瓶培养,重组菌的ALDC酶活为27.0 U/mL,约为出发菌酶活的70倍。经5 L的发酵罐发酵放大试验,ALDC酶活最高可达75.9 U/mL。

基因工程菌1020耐热木聚糖酶的纯化

目的:提纯基因工程菌1020耐热木聚糖酶。方法:超声破碎细胞,而后经过热变性处理和Ni-NTA亲和层析分离纯化。结果:根据pET System Manual的方法分析木聚糖酶主要分布在可溶性细胞质中;超声破壁功率400W,破碎15min时效果最佳;粗酶液经过70℃,热变性30min处理后,纯化倍数达到4.9;采用Ni-NTA Sephrose F.F一步层析可以得到电泳纯的木聚糖酶,纯化倍数13.4,得率29.4%。结论:热变性处理是一种有效的提纯手段,合理的条件可以使纯化倍数提高;Ni-NTA亲和层析是纯化含His标签的目的酶的特异高效纯化方法。

猪肺抑肽酶分离纯化及部分性质分析

以新鲜猪肺为材料,Sepharose4B偶联胰蛋白酶作为亲和层析介质,从猪肺中分离纯化高比活猪肺抑肽酶。结果表明,猪肺的抑肽酶含量为1.86mg/kg,酶比活力达4593U/mg;猪肺抑肽酶耐热性好、对pH敏感性低,在280nm处有最大光吸收,对胰蛋白酶有很强的抑制作用。

荚膜红细菌十聚异戊二烯焦磷酸合成酶异源表达及纯化的研究

目的构建生产辅酶Q10的大肠杆菌基因工程菌并研究相关酶的表达情况。方法将荚膜红细菌(Rhodobacter capsula-tusB10)中十聚异戊二烯焦磷酸合成酶编码基因ddsA分别克隆在Lac,T7和Trc启动子下游,使其在Escherichia coliJM83中表达。同时利用H is-tag的表达系统,对该酶的融合表达和镍柱纯化条件进行了研究。结果产物分析发现该基因在E.coli中表达出有活性的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并使宿主产生辅酶Q10。同时,28℃培养过夜,该酶以可溶形式存在于上清液中。在150 mmol.L-1咪唑的洗涤条件下,从镍柱上解离,并可以达到电泳纯。结论大肠杆菌可以表达Rhodobacter capsula-tusB10的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并合成辅酶Q10。

人TNFβ缺失体融合表达及其产物一步纯化法研究

本文将hTNFβN端缺失 2 3aa的缺失体基因克隆于 pET 2 8 C(+ ) 表达载体 ,构建成T7lac启动子控制下His6 TNFβ融合表达质粒 ,转化到E coliBL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达 ,His6 TNFβ表达量约占总菌体蛋白的 2 5 % ,Mr2 0 5 0 0。表达产物大部分以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤 ,70mol/L脲变性溶解 ,用Ni2 + 亲和层析一步快速纯化 ,所得His6 TNFβ的纯度达 90 %以上 ,回收率在 90 %左右。纯化产物稀释复性后 ,其细胞毒活性为 (0 5～ 1 0 )× 10 6U/mg蛋白左右。这些研究结果将为制备重组人TNFβ缺失体以及进一步研究其生物学功能奠定了基础。

人α-防御素-3基因乳腺特异性表达载体的构建及在兔乳腺中的瞬时表达

为探索人α-防御素-3(HNP-3)基因在兔乳腺中特异性表达的可行性,将HNP-3基因与大鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5′端调控区序列融合,定向克隆到PEGFP-1表达载体EGFP基因上游,在EGFP基因3′端加上His标签蛋白基因序列,构建了HNP-3基因乳腺定位表达载体pEGFP-WAP-HNP-S,将pEGFP-WAP-HNP-S与脂质体包裹后通过乳腺导管注射法转入妊娠母兔乳腺中,Westernblot和ELISA检测HNP-3融合基因在乳腺中表达和融合蛋白的表达水平,并用Ni亲和层析柱进行纯化。结果表明:分娩后初乳中即有分子质量为40kD的HNP-3融合蛋白表达,分娩后第4d达到高峰,表达量为265ng/mL。实验证明HNP-3融合基因在乳腺组织中能够特异性的表达。

重组人乙酰胆碱受体原核表达条件的优化及初步应用

在已建立的重组人乙酰胆碱受体表达质粒的基础上进一步优化试验条件,初步应用于ELISA分析实验性重症肌无力模型(EAMG)中抗体的滴度。取构建好的pET28a(+)-hAChRα1-210经小规模诱导,确定IPTG诱导的最佳浓度为0.006mmol/L,最佳时间为5h,最佳温度为37℃;大规模诱导培养后离心,超声得到菌体沉淀,1mol/L尿素洗涤后8mol/L尿素溶解,过Ni2+亲和层析柱,紫外吸收及Folin酚法确定表达量较多而蛋白最纯的4℃透析过夜,PEG8000浓缩后免疫雌性近交系Lewis鼠构建EAMG,ELISA检测分析模型大鼠血清中抗体的效价。结果表明,制备了大量较纯的rhAChR,并成功应用于ELISA法分析EAMG模型中抗体的滴度。因此,获得的纯化rhAChR可用于构建EAMG模型及鉴定。

梅毒螺旋体TpN17抗原的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中重组表达梅毒螺旋体Tp N17抗原,通过亲和层析方法进行纯化,获得纯度较高的Tp N17抗原,利用该抗原建立梅毒诊断血清学方法。方法:将化学合成的Tp N17基因序列,克隆到p ET 22b质粒并转化到大肠杆菌BL21菌株中进行IPTG的诱导表达。利用Ni2+亲和层析柱对表达抗原进行纯化。结果:对插入片段进行测序,证实该序列结果与合成序列一致,并在大肠杆菌中成功表达Tp N17抗原,通过亲和层析获得纯度较高的目的抗原。结论:本研究中构建的大肠杆菌重组表达载体可有效的表达Tp N17抗原,经纯化后的抗原,可有望进一步应用于梅毒感染的血清学检测试剂盒的研发。

抗小鼠H-Y抗原IgY抗体的纯化

用 Ni-NTA 柱纯化 SMCY 重组蛋白,将该蛋白作为配基偶联至 CNBr 活化的 Sepharose 4B制成亲和层析柱,分离纯化抗 H-Y 抗原的特异性 IgY 抗体。结果表明:Ni-NTA 柱纯化后,SMCY 重组蛋白纯度可达到80%左右;亲和层析柱纯化可以使IgY 抗体的纯度达到97%,经免疫组化检测,该抗体能够结合与雄性小鼠肝脏细胞表面,而不与雌性小鼠肝脏细胞发生结合。证实了经过纯化得到的高纯度 IgY 抗体具有很好的抗 H-Y 抗原特异性。通过该方法可纯化分离得到高纯度抗 H-Y 抗原 IgY 抗体。

重组人干扰素α_(2b)和胸腺肽α_1融合蛋白的分离纯化

考察了大肠杆菌E.coli表达的重组人干扰素α2b和胸腺肽lα融合蛋白包涵体的变性、复性及融合蛋白的分离纯化过程。实验结果表明:包涵体经7 mol/L盐酸胍,10 mmol/L DTT变性;1 mol/L尿素,2 mmol/L还原型谷胱甘肽,0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽脉冲加样稀释复性;金属螯合层析收集0.3 mol/L咪唑洗脱峰,冷干后经重组肠激酶30℃酶切24 h、Sephadex G-50柱纯化,可得到纯度达90%的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白,且最终目的融合蛋白产量达68 mg/g干菌体。

钙调素特异抗体的制备及ELISA定量法的建立

钙调素免疫原性很弱,不易用常规免疫方法制备出特异抗体。我们用Phenyl-Sepharose 亲和层析法自牛脑和人脑提纯钙调素,用未经化学修饰的牛钙调素与甲基化牛血清白蛋白混悬液免疫家兔,制备了特异 CaM 抗体;并用以建立了定量测定钙调素含量的竞争 ELISA 技术,测定方法简单、快速,批间和批内误差均<10%。

His-tag标记的嗜热菌来源L-脯氨酸脱氢酶的纯化与性质

以引入了His-tag做标记的超嗜热菌Thermococcus profundus色素依存性L-脯氨酸脱氢酶基因片段为目的基因,在宿主大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)CompetentCells中表达目的蛋白。细胞培养液经超声菌体破碎、热处理、NiSepharose层析分离,得到纯度较高的His-tag色素依存性L-脯氨酸脱氢酶,比酶活是纯化前的5倍。纯化后的酶液经凝胶电泳分离得到片段为58600,40200,22300的3段短肽。通过对该酶性质的初步探索,得出在温度50℃,体系pH8.0,300mmol/LTris缓冲溶液的条件下,L-脯氨酸脱氢酶酶活最高,为1.5U/mL。

抗菌肽cecropin P1在大肠杆菌中的融合表达及活性测定

目的在大肠杆菌中融合表达抗菌肽cecropin P1。方法根据抗菌肽cecropin P1的氨基酸序列,依照大肠杆菌密码子的偏爱性,采用SOE技术合成cecropin P1的编码基因;将其克隆至表达载体pET-32a(+)上,经IPTG诱导表达,超声上清液用Ni-NTA亲和层析初步纯化,经肠激酶切割后,用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法初步测定重组cecropin P1的活性。结果构建得表达质粒pET32-P1,经IPTG诱导表达获得融合蛋白TrxA-cecropin P1,占总蛋白质25%以上;纯化产物经肠激酶切割后,Tricine-SDS-PAGE显示成功释放抗菌肽cecropin P1;初步测定结果显示其有抑菌活性。结论本研究为研发重组抗菌肽cecropin P1的生产工艺奠定了基础。

犬瘟热病毒核衣壳蛋白的原核表达与鉴定研究

为了实现犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)核衣壳蛋白(N蛋白)在原核表达系统中的高效表达,试验参考GenBank中发布的CDV N基因序列(登录号为DQ522030.1),在不改变N蛋白氨基酸序列的情况下,对该基因的密码子进行优化,化学合成N基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-CDV N,将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,经IPTG诱导表达后利用His-tag镍柱进行纯化,对纯化后的CDV N重组蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定、浓度测定、Western-blot鉴定,并用犬瘟热抗原快速检测卡检测该重组蛋白的免疫反应性。结果表明:经PCR扩增成功合成大小约为1581 bp的CDV N基因;重组质粒pET28a-CDV N经过NdeⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,在1581 bp处出现条带,与预期结果相符;在诱导温度为30℃、IPTG诱导终浓度为0.4 mmol/L、诱导时间为8 h时,CDV N重组蛋白的表达量最高。经His-tag镍柱纯化,得到的CDV N重组蛋白纯度较高,浓度达1.7830 mg/mL,在60 ku处可见明显的蛋白印迹,犬瘟热抗原快速检测卡可检测出清晰的条带。说明CDV N重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,且免疫反应性良好。

与DNA硫修饰相关的DndB蛋白纯化体系的建立

根据DndB蛋白表达载体的特性,建立了一套集Ni2+-NTA亲和层析、Source Q阴离子交换层析和Superdex 200分子筛层析于一体的纯化体系,纯化得到高纯度的DndB蛋白,可用于后续的蛋白质结构生物学和酶学特性研究,为阐明DndB蛋白的功能以及DNA硫修饰的机理打下了良好的基础。

Anti-IgE单链抗体纯化工艺研究及活性鉴定

目的:建立anti-IgE单链抗体纯化工艺并对其活性进行鉴定。方法:根据protein L亲和层析填料和Ni亲和层析填料的特点分析,经初筛后选用protein L填料作为第一步初纯化填料,Ni亲和层析填料作为第二步精细纯化填料。通过对这两种纯化方式的上样条件和洗脱条件进行研究,建立了anti-IgE单链抗体的纯化工艺。结果:protein L亲和层析的初纯化工艺:最佳杂质洗涤pH=3.5,最佳目标蛋白洗脱pH=2.0,并且pH=2.0洗脱的目标蛋白收集在第二步Ni亲和层析的上样缓冲液中,可直接进行第二步Ni亲和层析纯化。所建立的Ni亲和层析精细纯化工艺:最佳杂质洗涤为50mmol/L咪唑,最佳目标蛋白洗脱为500mmol/L咪唑。经两步亲和纯化,目标产物在SDS-PAGE上纯度为99.0%,CE-SDS上纯度为99.5%,两步总收率为80.0%。纯化后的蛋白经竞争ELISA和Biacore检测,证实该产品特异性识别IgE靶标,与IgE靶标的亲和力达到8.59e^(-9)M,并且竞争Biacore结果显示该抗体对IgE有良好的中和活性,其抑制IgE的EC50值为70n M。结论:建立了一种高效、简洁的大肠杆菌表达的anti-IgE单链抗体纯化工艺,为其进一步规模放大工艺的建立奠定了基础。同时证明了该新型小分子anti-IgE抗体对靶标具有良好的特异性、亲和力以及中和活性,并展示出其在医用中的应用价值。所建立的小分子抗体纯化工艺技术对其他小分子单链抗体的纯化具有参考价值。

血管抑素对视网膜微血管内皮细胞的细胞外信号调节激酶水平的影响

目的 观察血管抑素对体外培养的鼠视网膜微血管内皮细胞的细胞外信号调节激酶(ERK 1)活性的影响。 方法 利用l lysine耦联的sepharose 4B亲和层析柱从血浆中分离和纯化血管抑素。原代培养鼠视网膜微血管内皮细胞分为4组:对照组,血管内皮因子(VEGF) 10ng/ml组,血管抑素13 0 μg/ml组,VEGF(10ng/ml) +血管抑素(13 0 μg/ml)组,Western blotting检测血管抑素对血管内皮因子刺激后1、2、5、10、15、3 0min的视网膜微血管内皮细胞ERK 1水平的影响。 结果 与对照组相比,经血管抑素处理后1min ,ERK 1水平开始下降,10min时下降最为显著,3 0min后对照组与血管抑素组ERK水平没有显著区别。VEGF刺激后,鼠视网膜微血管内皮细胞中ERK 1被迅速激活,5min后达到高峰,VEGF组ERK水平较对照组提高了2 10 % (P <0 .0 5 ) ;3 0min后,VEGF组ERK水平与对照组比较,差异无统计学意义(P >0 .0 5 )。而血管抑素能使ERK 1的表达量降低11.9% (1min)、17.9% (2min)、3 8 .7%(5min)、49.3 % (10min) (P <0 .0 5 )、2 7.9% (15min)、1.12 % (3 0min)。 结论 血管抑素在体外能有效的阻断VEGF由细胞外向细胞核传导的信号通路。