重组Tth DNA聚合酶基因的克隆表达及活性鉴定

Tth DNA聚合酶具有聚合酶与反转录酶两种功能,而且耐高温,但是国内并未实现高效生产.本研究以粗提的嗜热栖热菌Thermus thermophilus基因组为模板,采用PCR分段扩增和酶切连接的方法获得Tth DNA聚合酶基因全长序列;然后构建重组质粒pXT99b/Tth并转化表达菌E.coli DH5α,利用IPTG诱导Tth基因表达,并采用热处理、Ni2+柱纯化融合His-tag的Tth DNA聚合酶,最后利用PCR、RT-PCR鉴定其活性.结果显示,本研究获得Tth DNA聚合酶基因全长2 505bp,成功表达并获得高纯度高活性的重组Tth DNA聚合酶,1L发酵液所得粗酶液中,酶活性约有800 000U,酶的比活约为6 315U/mg.本研究最终实现了Tth DNA聚合酶的高效国产化并降低了实验成本.