老年痴呆症相关基因Nicastrin的转录调控(英文)

APP蛋白经过降解,形成老年痴呆症患者脑内老年斑的主要成分.由PS(早老素),NCT,PEN-2和APH-14种膜蛋白组成的γ分泌酶催化该降解过程.为了了解人类nicastrin(NCT)基因的转录调控机制,确定了其在人脑中的转录起始位点以及其编码区上游大小不等片段的转录起始活性.EMSA分析证实NCT启动子区的4个AP-1结合位点和2个NFAT结合位点能够与相应的转录因子结合,能够改变转录因子调控能力的定点突变和PDTC诱导使得NCT启动子在HeLa细胞和大鼠皮质神经元中的启动活性都有所改变.以上结果说明:AP-1和NFAT确实参与了人类NCT基因的转录调控.

老年性痴呆相关基因nicastrin启动子区单核苷酸多态性分析

【目的】分析老年性痴呆(Alzheimer病)相关基因nicastrin启动子区单核苷酸多态性(SNP),探讨其基因表达可能的分子调控机制。【方法】扩增nicastrin基因ATG上游约1.0kp启动子区DNA片段,与萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic进行重组质粒的克隆与鉴定,确立启动子区候选功能SNP及其相应位点结合的转录调节因子。应用Lipofectamine 2000对包含功能SNP的重组质粒进行CRL-2137细胞瞬时转染,双荧光素酶相对活性分析及电泳迁移率变动分析。【结果】Nicastrin基因启动子区960 bp DNA片段内存在功能SNP_rs10752637-922 G→T,与其相应位点结合的转录因子为hepatic leukemia factor(HLF),SNP_rs10752637-922 T的序列结构对启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达功能较SNP_rs10752637 -922 G的序列结构强(P<0.05,n=3)。【结论】Nicastrin基因核心启动子应该在960 bp DNA片段内,SNP_rs10752637-922 G→T可能是启动子区有功能位点突变,包含rs10752637-922 G/T的核苷酸序列结构可能通过与HLF在内的转录调节因子的作用来实现对nicastrin基因表达差异的调控。

蛋白酶体抑制剂处理神经细胞系后Nicastrin的表达变化及其与Aβ的关系

目的探讨蛋白酶体抑制剂处理后神经细胞内Nicastrin(NCT)的表达变化,及其与γ-分泌酶活性和Aβ生成的关系。方法运用亚细胞器分级分离技术、免疫共沉淀、Western blot和ELISA等检测神经细胞内NCT的表达及Aβ水平。结果正常情况下NCT主要分布于内质网和高尔基复合体,极少量分布于溶酶体,蛋白酶体抑制剂Lac-tacystin处理后NCT水平升高(P<0.001),且细胞内增多的NCT也主要聚集在内质网和高尔基复合体;NCT与泛素在细胞内共存;NCT的蛋白降解不受PS的影响;NCT降解受阻可引起细胞内γ-分泌酶的底物C99、C83显著减少,而γ-分泌酶的产物Aβ40、Aβ42的生成显著增多(P<0.01)。结论 NCT的降解可通过泛素-蛋白酶体途径实现,蛋白酶体抑制剂处理后神经细胞内NCT水平升高,且增多的NCT可促进APP的代谢及Aβ的生成。

Nicastrin:一种新型的γ-分泌酶组成蛋白

Nicastrin属Ⅰ型跨膜糖蛋白,新近被证实为γ-分泌酶复合体的组成部分.Nicastrin可调节γ-分泌酶复合体其他组分的稳定、转运等过程.Nicastrin的主要功能是通过γ-分泌酶复合体参与阿尔茨海默病中Aβ生成和Notch信号系统转导.

Nicastrin基因新选择性剪接与阿尔茨海默病的相关性研究

目的探讨Nicastrin基因转录产物的选择性剪接与阿尔茨海默病的相关性。方法通过使用RT-PCR法分别在病理确诊的10例AD患者与13例非AD对照中检测了海马区Nicastrin基因转录产物的选择性剪接,同时PCR-RFLP法进行apoE基因分型,对比分析Nicastrin基因、apoE基因与AD的相关性。结果我们发现Nicastrin基因上的一个新的选择性剪接转录产物-NCSTN△E16,该转录产物导致其跨膜结构域上游71个氨基酸缺失,在apoEε4携带者伴外显子16缺失阳性组中AD患病率明显增加,但这一相关性没有统计学意义。结论Nicastrin基因转录产物的选择性剪接-NCSTN△E16与AD没有明显相关性。

Nicastrin启动子区多态性与散发阿尔茨海默病相关性研究

目的探讨Nicastrin(NCSTN)基因启动子区多态性与散发阿尔茨海默病(sporadic Alzheimer s dis-ease,SAD)发病的关系及其机制。方法用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和直接测序的方法对中国北方汉族359例SAD患者和331名正常对照者NCSTN基因启动子区单核苷酸多态性位点(SNP)进行筛查,基因分型后,进行病例对照-相关分析。构建三种不同基因型启动子质粒,通过双荧光报告基因系统检测不同启动子质粒的转录活性。结果①中国北方人群中的NCSTN基因启动子区ATG上游2245 bp范围内存在3个SNP:-1216C/A(rs2147471),-796T/G(rs10752637)和-436C/T(rs1324738);②-1216C/A和-796T/G的基因型频率在各自的SAD组和正常对照组中的分布差异有统计学意义;③三种启动子质粒的转录活性差异无统计。结论NCSTN启动子区SNP:-796T/G和-1216C/A,与SAD的发病具有相关性,但未发现这两个位点具有病理学功能。

蛋白酶体抑制剂对神经细胞nicastrin表达的影响

目的:探讨蛋白酶体抑制剂能否引起神经细胞内nicastrin(NCT)蛋白表达及分布的变化,以明确NCT的蛋白降解是否与蛋白酶体有关。方法:在用人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)建立稳定表达NCT细胞株的基础上,应用蛋白酶体抑制剂处理NCT细胞株,并结合Western blotting、放射性同位素脉冲示踪技术、免疫荧光双标技术,检测蛋白酶体抑制剂处理后神经细胞内NCT的蛋白表达变化。结果:Western blotting结果显示,特异性蛋白酶体抑制剂处理后,神经细胞内源性和外源性转染的NCT的表达显著增强,高度特异的蛋白酶体抑制剂lacta-cystin对NCT蛋白的增强效应呈剂量依赖性和时间依赖性;放射性同位素脉冲示踪结果显示,蛋白酶体抑制剂可显著增强细胞内新合成的NCT蛋白的表达水平,其增强作用是通过阻止[35S]-NCT的蛋白降解来实现的;免疫荧光双标结果提示,NCT与泛素在细胞内共存。结论:神经细胞内NCT的降解由蛋白酶体途径介导;NCT在降解之前经泛素化修饰。

阿尔兹海默病相关基因nicastrin启动子的克隆和鉴定

目的:克隆和鉴定与阿尔兹海默病发生有关的γ-分泌酶的组成蛋白之一n icastrin(NCT)基因的启动子,用于开展其转录调控机制的研究。方法:用PCR方法从人基因组DNA中分离NCT基因编码区上游大小约为1.8 kb的片段并以此为基础对启动子进行两端删除分析,分别扩增大小不等的片段,与pGL3-Enhancer荧光素酶报告基因载体质量组,通过瞬时转染Hela细胞,细胞裂解液进行双荧光素酶活性分析,分离NCT基因的启动子区。结果:NCT基因启动子的420 bp片段在Hela细胞中具有最强的启动活性,另237 bp片段为有活性的最小片段。结论:NCT启动子很可能位于翻译起始位点上游-432/-133处,其基础启动子位于-359/-90。

溶酶体酶抑制剂对神经细胞内Nicastrin表达水平的影响

目的探讨溶酶体酶抑制剂对阿尔茨海默病(AD)相关蛋白Nicastrin(NCT)表达的影响,以期明确NCT的蛋白降解是否与溶酶体途径有关。方法在用人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y建立稳定表达NCT细胞株的基础上,应用溶酶体酶抑制剂处理NCT细胞株,并结合Western印迹、亚细胞器的分级分离、免疫荧光双标等技术,检测溶酶体酶抑制剂处理后神经细胞内NCT的表达变化。结果亚细胞器分级分离实验显示,正常情况下神经细胞内的NCT主要分布于内质网和高尔基复合体,少量NCT分布于溶酶体。Western印迹结果显示,溶酶体酶抑制剂处理后,神经细胞内源性和外源性成熟NCT(mNCT)的表达显著增强,且溶酶体酶抑制剂氯喹对mNCT蛋白表达的增强效应呈剂量依赖性和时间依赖性,但溶酶体抑制剂对非成熟NCT(imNCT)的表达无影响;免疫荧光双标结果显示,溶酶体酶抑制剂处理后,细胞内NCT的表达增强,且增多的NCT主要聚集在溶酶体内。结论神经细胞内mNCT的降解与溶酶体途径有关。

Nicastrin基因突变的反常性痤疮患者皮损Notch—HES信号通路的表达

目的检测nicastrin基因突变的反常性痤疮患者皮损标本中，nicastrin及其下游Notch—HES信号通路蛋白的表达。方法免疫组化法检测nicastrin及Notch—HES信号通路分子在4例nicastrin基因突变的患者皮损石蜡标本的表达，并用6例正常皮肤组织作对照，同时采用Spearman相关分析，分析nicastrin与Notch—HES信号通路分子表达的相关性。结果Nicastrin蛋白广泛表达于表皮全层、皮肤附属器，如，毛囊皮脂腺单位、大汗腺及小汗腺。在携带nicastrin基因突变的患者皮损中，表皮及毛囊漏斗部nicastrin表达较正常对照明显减少；同时，Notch—HES信号通路分子表达亦较正常对照明显减少。Nicastrin蛋白与Notchl、Notch3以及HES一1的表达呈明显正相关（r分别为0．831、0．748、0．807，P值分别〈0．01，〈0．05、〈0．01），而与Notch2、HES一5的表达之间的相关性，差异无统计学意义（r分别为0．597和0．591，均P〉0．05）。结论Nicastrin基因突变患者的皮损中nicastrin低表达，且与多种Notch—HES信号通路分子表达呈正相关，提示nicastrin表达减少可能通过影响下游Notch—HES信号通路的表达参与反常性痤疮的发病。

nicastrin基因沉默的HaCaT细胞基因表达谱分析

目的通过沉默人永生化角质形成细胞HaCaT细胞中nicastrin(NCSTN)基因的表达,研究其下游细胞增殖及分化相关信号通路的改变。方法将HaCaT细胞分为干扰组、阴性对照组和空白对照组:干扰组转染特异性NCSTN-siRNA,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组转染等量转染试剂。实时PCR及Western印迹检测各组NCSTN mRNA和蛋白表达验证转染效率。运用Agilent人类全基因组表达谱芯片技术研究干扰组HaCaT细胞基因表达谱与阴性对照组之间的差异,以表达上调或者下调倍数≥2.0且P≤0.05为标准,将差异基因用GO分析进行富集,筛选出表达差异显著且与角质形成细胞增生分化相关的基因,用实时PCR验证结果。结果干扰组HaCaT细胞NCSTN mRNA及蛋白相对表达量分别为0.287±0.090、0.443±0.085,明显低于阴性对照组(0.969±0.127、1.047±0.114)以及空白对照组(1.000±0.151、1.000±0.111),差异均有统计学意义(F值分别为30.787、31.139,P值均为0.001)。表达谱芯片显示,与阴性对照组相比,干扰组表达下调基因605条,上调基因444条。GO分析显示,干扰后差异表达基因富集到上皮发育、上皮细胞分化、角质形成细胞分化、角化4种生物学过程。对表达差异显著且与角质形成细胞增生分化相关的Sprouty相关蛋白2基因、表皮生长因子7基因、胰岛素样生长因子结合蛋白5基因、人Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶2基因和骨形成发生蛋白6基因通过实时PCR验证,验证结果与芯片结果显示的差异趋势一致。结论NCSTN基因功能缺失有可能通过调节其下游细胞增殖及分化相关信号通路的表达,影响角质形成细胞的正常增殖和分化。

反常性痤疮一家系nicastrin基因突变研究

目的 研究一家系2例汉族反常性痤疮患者γ分泌酶基因的突变。 方法 提取家系中5名成员（2例患者、先证者父亲、2例目前未发病者）的外周血DNA，扩增nicastrin蛋白（NCSTN）、早老素（PSEN） 1、早老素增强子（PSENEN）、前咽缺陷蛋白（APH1）基因所有外显子和侧翼序列进行测序，并以100例无关系健康人作为对照。同时比较先证者皮损与4个健康对照NCSTN基因mRNA表达差异。 结果 检测到2例患者血样DNA存在NCSTN基因中第477位碱基发生C→A的杂合突变，即c.477C〉A，其余3名家系成员及健康对照未发现相应突变；查询美国国家生物技术信息中心网站单核苷酸多态性数据库也未发现此突变。另外，先证者皮损NCSTN mRNA水平较健康对照明显减少。 结论 NCSTN基因新的无义突变c.477C〉A是该反常性痤疮家系的致病突变，并可能通过无义介导的mRNA降解途径导致该基因功能失活。

γ-分泌酶组件蛋白Nicastrin的研究进展

Nicastrin(NCT)是高度糖基化的I型跨膜蛋白,是γ-分泌酶复合物的重要组件蛋白之一,广泛分布于人类或鼠的所有细胞类型。它不仅与γ-分泌酶的组装和成熟密切相关,其构象及表达变化对γ-分泌酶活性和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)中β淀粉样蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)的产生及降解也起重要调节作用。本文就国际上近几年在NCT的结构、合成、分布、降解及功能等方面的研究进展作一综述。

超表达转运膜蛋白21对介导阿尔茨海默氏病γ分泌酶复合物重要组分PS-1及NCT蛋白表达量的影响

研究转运膜蛋白21(TMP21)在小鼠胚胎成纤维细胞中超表达对PS-1及NCT蛋白表达量的影响.脂质体介导TMP21 cDNA转染敲除淀粉样前体蛋白表达基因的小鼠胚胎成纤维细胞系(MEF(KO)),以梯度浓度G418筛选TMP21表达量最高的细胞.处理超表达组(T)和对照组(C)细胞,并收集纯化过程中含γ分泌酶复合物的样本,用Western blotting检测γ分泌酶复合物重要组分Nicastrin(NCT)、Presenilin-1(PS-1)以及TMP21的蛋白表达量.结果表明,样本T1、T2及IPT2所含TMP21的蛋白表达量较相应对照组样本C1、C2和IPC2分别上升11.5%(P=0.08)、28.1%(P<0.01)及69.1%(P<0.001),提示经TMP21 cDNA转染后MEF(KO)细胞中TMP21蛋白表达明显提高,而转染组和对照组中,构成γ分泌酶复合物的重要组分NCT与PS-1蛋白表达量无明显变化.这表明在TMP21蛋白高表达状态下,不会影响MEF(KO)细胞中γ分泌酶复合物的重要组分NCT与PS-1蛋白表达量.

nicastrin基因沉默的斑马鱼模型构建及其色素异常机制的初步研究

目的探讨nicastrin(nct)基因对斑马鱼黑素细胞生物学功能的影响。方法利用吗啉代寡核苷酸(MO)技术针对斑马鱼nct基因mRNA设计nct-MO序列,同时设计对照MO序列(ctrl-MO),并构建5′端为MO靶序列的增强绿色荧光蛋白(EGFP)mRNA,通过显微注射的方式将nct-MO或ctrl-MO与EGFP mRNA共注射入斑马鱼胚胎中,验证nct-MO的沉默效率,观察其表型变化。以野生型斑马鱼作为空白对照组,实时荧光定量PCR检测黑素合成notch信号通路相关基因mitfa、tyr、tyrp1a、tyrp1b、dct、pmela、notch1a、notch1b、hey1 mRNA表达水平的变化。多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果斑马鱼受精后8 h,ctrl-MO+EGFP mRNA组斑马鱼胚胎中均有绿色荧光表达,而nct-MO+EGFP mRNA组及空白对照组胚胎均未见绿色荧光。受精后48 h,nct-MO组幼鱼尾部色素沉着区面积占比(0.169±0.083)低于ctrl-MO组(0.258±0.042,t=3.202,P=0.005),且nct-MO组色素分布紊乱。实时荧光定量PCR显示,nct-MO组、ctrl-MO组、空白对照组间pmela、tyrp1a、hey1基因mRNA相对表达量差异有统计学意义(均P<0.05),mitfa、tyr、tyrp1b、dct、notch1a、notch1b mRNA相对表达差异无统计学意义(均P>0.05);nct-MO组pmela、tyrp1a相对表达水平(0.708±0.028、0.558±0.136)低于ctrl-MO组(1.023±0.142、1.016±0.134,均P<0.05)。结论nct基因可能通过调控斑马鱼黑素合成影响黑素细胞生物学功能。

还脑益聪方提取物对淀粉样前体蛋白/早老蛋白1双转基因痴呆模型小鼠学习记忆能力的改善作用及其机制

目的探讨还脑益聪方(HYD)提取物改善学习记忆能力的作用机制。方法 3月龄淀粉样前体蛋白(APP)/早老蛋白1(PS1)双转基因小鼠,随机分为模型对照、盐酸多奈哌齐0.65 mg·kg-1、HYD提取物1.7和3.4 g·kg-1组,同龄C57BL/6J小鼠为正常对照。给药组小鼠ig给药,每日1次,连续6个月。给药结束后以跳台实验和Morris水迷宫实验观察小鼠行为变化,HE染色观察小鼠海马CA1区神经元形态变化,实时RT-PCR测定海马组织PS1、热休克蛋白70羧基端作用蛋白(CHIP)、鸟苷酸结合蛋白(CDC42)、呆蛋白(NCT)、激活蛋白-1(AP-1)和活化T细胞核因子(NFAT3)mRNA表达。结果与正常对照组比较,模型组小鼠跳台实验的错误次数增加(P<0.05),潜伏期缩短(P<0.01);水迷宫实验的穿台次数减少(P<0.05),潜伏期延长(P<0.05);海马CA1区神经元数量明显减少,形态结构有所破坏,PS1和CHIP mRNA表达均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,跳台实验中多奈哌齐、HYD提取物1.7和3.4 g·kg-1组小鼠的错误次数分别由模型组的5.1±1.2减少至2.2±1.1,2.7±1.2和2.1±1.2(P<0.05),潜伏期由(70±27)s延长至130±33,162±33和(213±38)s(P<0.01);水迷宫实验中小鼠的穿台次数分别由2.1±1.8增加至3.5±1.9,3.6±2.0和3.8±1.8(P<0.05),潜伏期由(139±57)s缩短至95±58,95±58和(94±56)s(P<0.05);海马CA1区神经元数量明显增多,形态较完整;HYD提取物1.7和3.4 g·kg-1可明显降低APP/PS1双转基因小鼠海马PS1 mRNA表达(P<0.05,P<0.01),使CHIP mRNA表达进一步升高(P<0.01),对CDC42,NCT,AP-1和NFAT3 mRNA表达均无明显影响。结论HYD提取物具有提高APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的作用,该作用可能与其保护神经元和降低PS1mRNA表达有关。

人源γ-分泌酶的重要亚基nicastrin蛋白表达与纯化

γ-分泌酶是具有天冬氨酸内切酶活性跨膜蛋白复合物,与阿尔茨海默症的病理特征的β-淀粉样蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)生成有关。Nicastrin(NCT)是Ⅰ型单次跨膜糖蛋白,具有709个氨基酸。它是γ-分泌酶的重要组分,具有募集和结合γ-分泌酶底物的功能,参与γ-分泌酶的组装过程。本研究中,利用昆虫杆状病毒表达系统表达人源NCT全长和胞外结构域,得到了纯度较好的蛋白,用于晶体初筛。由于nicastrin自身高度糖基化,使用Endo H和PNGase F去糖基化酶进行体外脱糖基作用,使得蛋白均一度提高,纯化到较稳定的胞外结构域蛋白,为下一步对人源nicastrin蛋白进行结构生物学研究奠定了基础。

γ-分泌酶组件NCT在痴呆小鼠中枢神经系统的分布及表达

目的研究γ-分泌酶组件蛋白单过性跨膜蛋白(NCT)在APP/PS1双重转基因痴呆小鼠中枢神经系统(CNS)中的分布与表达及与阿尔茨海默病(AD)的关系。方法对APP/PS1双重转基因AD模型种鼠交配后产下的子代进行基因分型,分别用免疫组化、免疫荧光双标及激光共聚焦等技术,检测NCT在APP/PS1双重转基因痴呆小鼠及同窝野生型小鼠CNS内的分布及表达。结果 NCT广泛分布于成年AD小鼠CNS各区域,包括大脑新皮质、海马、嗅脑、丘脑、纹状体、小脑、脑干和脊髓等;而神经元外Aβ的沉积选择性分布于CNS的大脑皮质和海马等区域;大脑皮质及海马内的NCT阳性神经元数量要多于Aβ阳性神经元,且神经元内的Aβ与NCT出现了共存;同时,大脑皮质和海马内的NCT与PS1分布趋势高度一致,且在神经元内出现了共存。痴呆型与同窝野生型新生小鼠大脑皮质内NCT阳性神经元排列致密;随着小鼠的发育,脑组织单位面积内NCT阳性神经元数量逐渐减少;但痴呆小鼠脑内NCT阳性神经元的细胞膜和细胞质均浓染;而同窝野生型小鼠脑内的NCT阳性神经元仅细胞膜周围染色较深,而胞质染色极浅甚至不着色。结论 NCT在痴呆小鼠和正常野生型小鼠脑内的分布及表达出现差异,可能与Aβ的生成和AD的发生相关。

SH-SY5Y细胞α7尼古丁受体基因抑制对APP代谢的影响

目的采用RNA干扰技术抑制神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)中α7神经型尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)基因表达,了解对β淀粉样前体蛋白(APP)代谢中的γ-分泌酶两个重要组分早老蛋白(PS)及单过性跨膜蛋白(NCT)水平的影响。方法 SH-SY5Y细胞转染针对α7nAChR的小干扰RNA(siRNA),用实时PCR法和Western印迹法分别测定细胞中α7 nAChR、PS及NCT在mRNA和蛋白表达水平的变化。结果转染α7 nAChR siRNA后,与对照组相比,α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平明显降低;PS蛋白mRNA及蛋白水平均升高,而NCT水平无明显变化。结论α7 nAChR基因表达抑制后γ-分泌酶组分之一PS的水平明显升高,这种改变可能与α7 nAChR基因表达抑制后β-淀粉样蛋白(Aβ)的产生增多有关,可能与阿尔茨海默氏病(AD)的发病有一定的关系。

家族性反常性痤疮/化脓性汗腺炎一例

23岁男性患者,项部、胸部及臀部毛囊性炎性丘疹、结节、脓肿伴瘢痕5年。家族成员有类似皮损表现。皮肤科情况:项部多发炎性丘疹、结节、脓肿,可挤出脓性分泌物,胸部散在红色丘疹、结节,臀部可见脓肿贯通形成窦道,伴白色条索样或萎缩性瘢痕形成。项部皮损组织病理:毛囊周围及真皮上部可见以中性粒细胞为主的混合炎性细胞浸润。基因测序显示NCSTN基因第11外显子第1300位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶(c.1300C>T),导致第434位密码子由CGA(精氨酸)变为TGA(终止密码子)。家族中其他患者有相同突变,未患病成员及50名正常对照均未发现上述突变。诊断:反常性痤疮/化脓性汗腺炎。治疗:多西环素100mg每日2次口服。治疗4周后,患者炎性丘疹及分泌物明显改善,部分皮损留有瘢痕。随访3个月,项部、胸部及臀部皮损较稳定,背部有部分新发炎性丘疹及结节。