脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1在肿瘤发生发展及治疗中的作用研究进展

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(APE/Ref-1)是一种具有DNA修复和转录调控双重功能的蛋白质,其在肿瘤细胞中的高表达与肿瘤发生发展紧密相关。激素如17β-雌二醇可促进APE1/Ref-1的分泌,影响其表达。APE1/Ref-1抑制剂,如C10和E3330,已在实验中显示了抑制肿瘤细胞增殖和增强化疗药物敏感性的潜力,但APE1/Ref-1抑制剂的临床应用安全性和最佳时机需更多研究探讨。

血清脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1自身抗体、生长分化因子15水平对结直肠癌患者术后复发转移的预测价值

目的分析血清脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1自身抗体(APE1-AAbs)、生长分化因子15(GDF-15)水平及对结直肠癌患者术后复发转移的预测价值。方法选取52例结直肠癌患者为观察组,并根据预后情况分为术后复发转移组(n=15)和术后未复发转移组(n=37)。选取同期正常体检健康者52例为对照组。检测APE1-AAbs、GDF-15水平。采用Pearson相关性分析法分析APE1-AAbs、GDF-15与结直肠癌术后复发转移的相关性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析APE1-AAbs、GDF-15对结直肠癌术后复发转移的预测价值。结果观察组的APE1-AAbs、GDF-15水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。术后复发转移组的APE1-AAbs、GDF-15水平高于术后未复发转移组,差异有统计学意义(P<0.05)。APE1-AAbs、GDF-15水平与结直肠癌术后复发转移呈正相关(P<0.05)。APE1-AAbs、GDF-15联合预测结直肠癌术后复发转移的价值高于APE1-AAbs、GDF-15单独预测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论APE1-AAbs、GDF-15在结直肠癌患者血清中呈高表达。APE1-AAbs、GDF-15或可作为结直肠癌术后复发转移的标志物。

玛巴洛沙韦:首个靶向于Cap-依赖性核酸内切酶的抗流感药物

玛巴洛沙韦是首个Cap-依赖性内切酶抑制剂,通过抑制流感病毒RNA聚合酶酸性蛋白亚基内切酶活性,从而抑制流感病毒的复制。玛巴洛沙韦于2022年8月通过美国食品药品监督管理局(FDA)审批,在临床上用于治疗5岁及以上、流感症状不超过48 h的急性无并发症流感患者,并于2023年3月获得中国国家药品监督管理局正式批准。临床试验表明,玛巴洛沙韦具有单剂量给药、安全性高等优势,将成为儿童流感患者的替代药物。

IS200/IS605转座子家族编码的核酸酶OgeuIscB基因编辑体系的优化

目的提升来源于IS200/IS605转座子家族的RNA引导的核酸内切酶OgeuIscB的基因编辑效率。方法利用OgeuIscB蛋白已解析的晶体结构,计算氨基酸与核酸之间的原子距离,将距离小于10的非正电荷氨基酸残基突变为精氨酸(arginine,R)以提高OgeuIscB与核酸的亲和力,通过人胚肾293T细胞内源性位点验证不同突变体的基因编辑效率。结果经过两轮迭代突变,发现Q376R-S456R和A401R-S456R这2个双突变体在不同细胞系的多个内源性位点上均能显著提升OgeuIscB的基因编辑效率。结论基于结构对OgeuIscB蛋白进行理性蛋白质工程化改造,能够提升OgeuIscB核酸内切酶活性,为将其作为一种有效的基因编辑工具提供了实验依据。

Nei核酸内切酶Ⅷ样蛋白1对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞凋亡与自噬的影响

目的探究Nei核酸内切酶Ⅷ样蛋白1(NEIL1)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的晶状体上皮细胞(LECs)凋亡与自噬的影响。方法以年龄相关性白内障(ARC)患者、接受透明晶状体摘除术的黄斑前膜患者的晶状体前囊膜样本和晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞为研究对象,采用RT-PCR实验检测NEIL1 mRNA表达。将SRA01/04细胞随机分为对照组、OE-Vector组和OE-NEIL1组,采用RT-PCR和Western blot检测过表达效率;将细胞随机分为对照组、H_(2)O_(2)组、OE-Vector H_(2)O_(2)组、OE-NEIL1 H_(2)O_(2)组,采用CCK-8法检测细胞活力,Western blot检测自噬相关蛋白(ATG7、P62、Beclin1、LC3-I和LC3-II)和凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)的表达,荧光染色检测细胞凋亡与线粒体膜电位情况。结果ARC患者晶状体前囊膜样本中的NEIL1 mRNA表达显著低于黄斑前膜患者,且H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞中NEIL1 mRNA的表达同样低于对照组(均为P<0.05)。RT-PCR与Western blot检测结果显示,OE-NEIL1组SRA01/04细胞中NEIL1 mRNA和蛋白表达均显著高于OE-Vector组(均为P=0.000)。与对照组相比,H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞中细胞活力显著降低;Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调;Mito-Tracker标记活细胞数显著减少,Annexin V-FITC标记的凋亡细胞数显著增多,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与OE-Vector H_(2)O_(2)组相比,OE-NEIL1 H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞中细胞活力显著升高;自噬相关蛋白(ATG7、P62、Beclin1、LC3-I和LC3-II)表达均显著上调;Bax蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调;Mito-Tracker标记的活细胞数增加,Annexin V-FITC标记的凋亡细胞数减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论在H_(2)O_(2)诱导氧化应激条件下,NEIL1可通过促进LECs的自噬,维持LECs内环境稳定,增加其细胞活力从而减少LECs凋亡,参与ARC的发生发展。

限制性核酸内切酶Asc I蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析

限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制。RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Asc I是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶,能识别8-bp DNA基序。尽管Asc I已经被广泛应用于分子克隆研究中,然而目前尚无关于Asc I蛋白质的表达、纯化以及结构机制等方面的研究报道。本研究基于大肠杆菌重组表达体系建立了Asc I重组蛋白质的高效表达和纯化方法,从每升细菌培养物中可获得约2.5 mg纯度大于95%的Asc I蛋白质。进一步的酶学性质研究表明,Asc I酶切反应的最适温度是37℃,最适pH为7.5~8.5,反应依赖于Mg^(2+)和Mn^(2+)等二价金属离子。基于小角X射线散射(SAXS)分析技术,我们还建立了Asc I蛋白质及其与底物DNA复合物在溶液状态下的三维空间模型,并结合点突变对该模型进行了验证。总之,本研究对Asc I蛋白质的重组表达、纯化、酶活性质以及结构机制进行了比较系统地研究,为了解RMS系统的工作机制提供了结构基础,同时也为Asc I作为分子克隆工具酶的进一步开发和改造提供了理论依据。

肺鳞状细胞癌组织中Flap-核酸内切酶1和复制因子C2的表达及临床意义

目的探讨肺鳞状细胞癌组织中Flap-核酸内切酶1(Flap-endonuclease 1,FEN1)和复制因子C2(replication factor C2,RFC2)的表达及其临床意义。方法采用生物信息学方法分析FEN1、RFC2在肺鳞状细胞癌组织中的表达;采用免疫组化法检测80例肺鳞状细胞癌及癌旁组织中FEN1和RFC2蛋白的表达,利用RT-PCR法检测两者mRNA表达并分析相关性,分析FEN1、RFC2与临床病理特征的关系;收集患者随访资料,绘制患者的生存曲线。结果FEN1和RFC2在肺鳞状细胞癌组织中的高表达率分别为77.50%(62/80)、70.00%(56/80),在癌旁组织中的高表达率分别为42.50%(34/80)、32.50%(26/80),与公共数据库分析结果一致。RT-PCR结果显示,肺鳞状细胞癌组织中RFC2、FEN1 mRNA表达均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.01);相关性分析结果显示,两者的表达存在明显正相关。不同TNM分期患者的FEN1、RFC2蛋白表达差异有统计学意义,是否存在胸膜侵犯与RFC2蛋白的表达差异有关。FEN1、RFC2高表达肺鳞状细胞癌患者的总生存期均低于低表达组。单因素分析结果表明:RFC2高表达、FEN1高表达、TNM分期与肺鳞状细胞癌患者的预后有关;多因素分析结果表明:TNM分期、FEN1和RFC2高表达是影响肺鳞状细胞癌患者预后的独立危险因素。结论FEN1和RFC2有助于评估肺鳞状细胞癌患者的预后,两者之间存在协同作用,可能成为新的肿瘤标志物。

芹菜核酸内切酶CELI基因的克隆及其表达分析

CELI是一种单链特异性核酸酶(singlestrand specific nuclease),主要应用于清除DNA或RNA双链分子存在的单链。测定不同品种芹菜中CELI基因非生物胁迫诱导表达情况,以进一步研究芹菜中核酸内切酶的功能及应用。以芹菜(Apium graveolens L.)为试验材料,分别从‘六合黄心芹’和‘文图拉’中克隆出核酸内切酶CELI基因序列。通过生物信息学的方法对所得序列进行分析,通过实时定量PCR方法进行该基因在芹菜中表达分析。结果表明:来源于2种芹菜的CELI基因核苷酸序列高度保守,基因全长均为891 bp,分别编码296个氨基酸。2种芹菜的CELI基因核苷酸序列之间共有20个位点不同,导致3个氨基酸位点发生改变。2种芹菜该酶的蛋白质相对分子质量分别为33.88×103和33.92×103,pI值分别为6.51和6.37。进化分析显示,芹菜中的CELI与同属于伞形科的欧芹进化关系最近,伞形科CELI进化上更接近于菊科。实时定量PCR分析表明,芹菜中CELI基因在根、茎、叶、花不同组织及不同品种之间的表达量有明显差异。对2种芹菜分别进行4℃、38℃、0.2 mol·L-1NaCl、200 g·L-1PEG处理2 h,表达分析显示,4种处理条件下芹菜中CELI基因表达量有明显差异,其中PEG处理表达量呈明显下降趋势。结论:通过逆境处理后的基因表达分析发现,芹菜中CELI基因对非生物胁迫有响应,‘六合黄心芹’中CELI基因的诱导表达量大于‘文图拉’。

大黄素对大鼠肝癌细胞凋亡诱导因子及核酸内切酶G mRNA表达的影响

目的研究大黄素(emodin,EM)对大鼠肝癌细胞CBRH-7919细胞凋亡及凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)和核酸内切酶G(endonuclease G,EndoG)mRNA表达的影响,探讨大黄素的抗癌机制。方法实验分空白对照组、Caspase抑制剂Z-VAD-FMK干预组、大黄素组、大黄素+Z-VAD-FMK组共4组,采用四氮唑盐(MTT)还原法筛选大黄素的干预条件,根据结果选择44.8μmol/L的大黄素干预48h作为干预条件;以原位末端标记法(Tunel)检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,QT-PCR)法检测AIF、EndoGmRNA。结果大黄素能抑制肝癌CBRH-7919细胞株的增殖,诱导其凋亡,与空白组相比差异具有显著性(P<0.01);QT-PCR检测显示,大黄素及大黄素+Z-VAD-FMK组细胞AIF、EndoG mRNA表达上调,与空白组比较,差异具有显著性(P<0.01)。结论大黄素可上调CBRH-7919细胞AIF、EndoG表达,通过启动非Caspase依赖通路而发挥促凋亡的作用。

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析。方法用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1。将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定。用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白。用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性。结果所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确。IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确。Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性。结论成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E.coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白。

大鼠局灶性脑缺血再灌注早期非嘌呤非嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1表达的研究

目的 探讨大鼠大脑中动脉阻塞再灌注 (MCAO/R)后 ,DNA修复酶非嘌呤非嘧啶核酸内切酶 /氧化还原因子 1(APE/Ref 1)的表达变化及其意义。方法 采用免疫组织化学方法检测APE/Ref 1在缺血再灌注早期损伤脑组织中的变化。结果 自再灌注 2h起 ,损伤侧APE/Ref 1表达阳性细胞数较相应的假手术对照组和正常组显著下降(P <0 .0 1) ,至 48h各手术组间APE/Ref 1表达并无明显差异 (P >0 .0 5 ) ,72h时损伤区域APE/Ref 1表达较其他手术组减少 (P<0 .0 1) ;2～ 48h ,损伤侧及损伤对侧相应区域部分APE/Ref 1的表达出现于胞质 ,72h时损伤对侧恢复为胞核表达 ,且无细胞减少。结论 局灶性大鼠脑缺血再灌注早期 ,DNA修复酶APE/Ref 1在损伤区域的表达水平降低 ,并出现该蛋白的胞质滞留现象 。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶与卵巢上皮性癌耐药相关性研究

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)与卵巢上皮性癌耐药性的相关性以及其在卵巢癌化疗耐药中的作用机制。方法应用免疫组织化学法对78例原发性卵巢上皮性癌组织和卵巢癌顺铂敏感株A2780、顺铂耐药株CP70中APE1的表达进行测定。结果APE1在卵巢上皮性癌组织中呈胞核表达、胞浆表达或核浆共同表达。化疗敏感组和耐药组的APE1表达强度间差异有统计学意义(P=0.045),核表达者化疗敏感率与浆表达、核浆表达者比较差异有统计学意义(P=0.037)。在卵巢癌顺铂耐药株CP70中APE1表达水平较顺铂敏感株A2780明显增高。结论APE1表达强度和定位与以铂类为基础化疗药物的敏感性相关,对卵巢癌的化疗疗效有提示作用,检测APE1对前瞻性预测化疗药物敏感性和判断化疗疗效具有一定的临床指导价值。

核酸内切酶在细胞凋亡中的作用

核酸内切酶在形成细胞凋亡的典型特征———DNA片段化中 ,发挥着直接的重要作用 .介绍了已知的参与细胞凋亡的二价金属离子依赖性和非依赖性核酸内切酶种类 ,其中二价金属离子依赖性主要有nuc1 8、DNaseⅠ、Ca2 +/Mg2 +核酸内切酶、Ca2 +/Mn2 +核酸内切酶、DNaseγ、nuc58和nuc4 0 ;二价金属离子非依赖型主要有DNaseⅡ及类似核酸内切酶 .此外 。

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的制备人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAPE1)单克隆抗体(mAb)并对其生物学特性进行鉴定。方法以hAPE1融合蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,运用细胞融合、克隆化技术和间接ELISA法获得并筛选针对hAPE1的杂交瘤细胞,以体内诱生法产生腹水,并用Protein G柱亲和纯化得到hAPE1 mAb。采用秋水仙素阻断法、Western blot和间接ELISA法鉴定mAb的染色体核型、特异性、种属交叉反应、亚类、效价和亲和力,并应用于免疫荧光、免疫细胞化学和免疫组化实验中评价mAb性能。结果获得2株分泌稳定、高特异性的hAPE1 mAb的杂交瘤细胞株2-G1和4-F6,其效价均超过1:107,Ig亚类分别是IgG2b和IgG3,亲和常数分别为1.8×10-7和3.4×10-5,与兔、小鼠、大鼠无种属交叉性。2-G1mAb可应用于免疫细胞化学、免疫细胞荧光和免疫组织化学等实验技术中。结论成功获得2株稳定分泌抗hAPE1mAb的杂交瘤细胞株,产生的mAb具有高纯度、高效价和高特异性的特性,能特异性识别hAPE1天然蛋白和融合蛋白,为开展多种免疫学实验及研究提供必要的物质基础。

核酸内切酶抑制剂对三尖杉酯碱诱导HL_(60)细胞凋亡的影响

目的探讨核酸内切酶在三尖杉酯碱诱导ＨＬ６０细胞凋亡中的作用。方法以流式细胞仪和ＤＮＡ凝胶电泳检测ＨＬ６０细胞在核酸内切酶抑制剂及三尖杉酯碱作用下，细胞凋亡的发生。结果核酸内切酶抑制剂抑制了细胞凋亡。结论三尖杉酯碱诱导ＨＬ６０细胞凋亡需要核酸内切酶参与。

T4核酸内切酶V的分离纯化

<正> T_4核酸内切酶V[endodeoxyribonuclease(Pyrimidine dimer)EC 3.1.25.1,简称Endo V]是由噬菌体T_4感染宿主E.coli后产生的一种修复酶。它能特异识别紫外线(UV)辐射在DNA引起的损伤产物环丁烷嘧啶二聚体(PD),在组成PD的两个嘧啶核苷酸之间切割磷酸二酯键,造成单链缺刻,从而启动E.coli体内的切除修复途径~[1]。Endo

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1的研究进展

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶 /氧化还原因子 1(APE/Ref- 1)具有修复 DNA损伤、影响氧化还原反应及调节转录因子DNA结合活性等功能 ,对细胞的生存有重要作用。近年来有关 APE/Ref- 1的研究在其基因、功能、分布以及与某些疾病尤其是神经系统疾病和肿瘤之间的关系等方面都取得了长足的进展 。

基于远红外荧光标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶活性检测方法的建立

目的建立远红外荧光标记的脱嘌呤脱嘧啶(apurinic/apyrimidinic,AP)核酸内切酶活性检测方法。方法通过5'标记远红外荧光基团(IR700)合成得到AP核酸内切酶活性检测底物,并通过与经典的同位素法对比,检验此方法的可靠性、灵敏度及实用性。结果远红外荧光标记法较传统的同位素法检测AP核酸内切酶更为敏感(10%上升到30%),且操作时间从传统的1 d缩减至2 h。结论远红外荧光标记法检测AP核酸内切酶活性更敏感,且操作方便、无放射性污染,易于推广。

两步亲和层析纯化限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ

以Bacillussphaericus63为材料 ,采用DNA Sepharose4B和CibacronBlueF3GA Sepharose4B两步亲和层析 ,分离纯化得到电泳均一纯限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ .酶的得率约为 1 3 0单位 /g湿菌 ,比活力高达 61 4 0 0单位 /mg蛋白 .还报道了DNA -Speharose 4B两种亲和吸附剂制作方法的改进 .

斑点热群立克次体中国分离株染色体DNA限制性核酸内切酶分析

应用限制性核酸内切酶Hind Ⅲ、BamHI、Pst Ⅰ及EcoRI,对本研究室从斑点热病人分离的立克次体An-84、Se-85、W-883株,从蜱分离的FT-84、MT-842株、从蜱卵分离的TO-85株及中国参考株JH-74蜱株与7株斑点热群立克次体国际标准株,进行了染色体DNA限制性核酸内切酶酶切片段电泳图谱分析。结果表明不同种的斑点热群立克次体国际标准株的DNA酶切图谱不相同,各具特征。7株中国分离株与国际标准株西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)的DNA酶切图谱完全一致,株间未发现有差异。由此证明中国分离株均属西伯利亚立克次体,所致疾病为北亚蜱传斑点热(NorthAsia Tick-Borne Spotted Fever)。