应用化学专业实践教学与科学研究相融合的创新型人才培养模式的研究与探索——以“红树内生真菌Nigrospora sphaerica S5中毛色二孢霉素的分离纯化与鉴定研究”为例

为充分发挥实践教学在应用化学创新型人才培养中的关键作用,探索与科学研究相融合的创新型人才培养的实践教学模式,通过依托本科生导师制和创新班,精选科研项目内容以“红树内生真菌球黑孢霉菌Nigrospora sphaerica S5中化合物毛色二孢霉素lasiodiplodin的分离纯化及鉴定研究”为例开展实践教学探索,指导学生首次在国内外从Nigrospora属真菌中发现并分离到lasiodiplodin。将应用化学专业实践教学与科学研究相融合,锻炼了学生的综合实践和科研创新能力,使学生更好地了解到本专业学科前沿,掌握了相关大型仪器设备使用技能,有效推动了应用化学专业创新型人才的培养。

海洋真菌Nigrospora sphaerica化学成分的分离与鉴定(Ⅰ)

目的对海洋真菌Nigrospora sphaerica中的化学成分进行研究。方法采用硅胶柱色谱、凝胶以及HPLC等方法进行分离纯化,根据理化性质和光谱数据进行结构鉴定。结果分离得到10个化合物,分别鉴定为尿嘧啶（uracil,1）、胸腺嘧啶（thymine,2）、半乳糖醇（D-galactitol,3）、5α,8α-过氧麦角甾-6,22E-二烯-3β-醇（5α,8α-epidioxy-（22E,24R）-ergosta-6,22E-dien-3β-ol,4）、5α,8α-过氧麦角甾-6,9,22E-三烯-3β-醇（5α,8α-epidioxy-（22E,24R）-ergosta-6,9,22E-triere-3β-ol,5）、丁二酸（succinic acid,6）、4-（2-羟乙基）苯酚（4-（2-hydroxyethyl）phenol,7）、3-异丁基-7-羟基-吡咯并哌嗪-1,4-二酮（3-isobutyl-7-hydroxy-pyrrolopiperazine-1,4-dione,8）、对羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoicacid,9）和苯乙酸（phenylacetic acid,10）。结论海洋真菌Nigrospora sphaerica为首次从海洋中分离得到,化合物4~10为首次从该真菌中分离得到。

银耳瓦灰霉病原菌球黑孢菌(Nigrospora sphaerica Mason)生物学特性研究

对段木栽培银耳过程中新出现的瓦灰霉病害的病原菌球黑孢菌(NigrosporasphaericaMason)的菌丝生长和孢子萌发条件进行了研究,结果表明:病菌生长的最适宜温度为23～26℃,最适产孢温度为23℃;最适宜生长的pH为6～7,最适产孢pH为5～6,Mg2+、K+等矿质元素能促进瓦灰霉病菌菌丝的生长和产孢。

海洋真菌Nigrospora sphaerica的化学成分(Ⅱ)

目的对海洋真菌Nigrospora sphaerica中的化学成分进行研究。方法采用硅胶柱色谱、凝胶以及HPLC等方法进行分离纯化,根据理化性质和光谱数据进行结构鉴定。结果分离得到了8个化合物,分别鉴定为柄曲霉素(sterigmatocystin,1)、4-苄基-3-苯基-5氢呋喃酮(4-benzyl-3-phenyl-5H-furan-2-one,2)、异黄光素[7,8-dimethyl,benzo(g)pteridine-2,4(1H,3H)-dione,3]、5,8二羟基-7甲氧基黄酮(5,8-dihydroxy-7-methoxy-2-phenyl,4H-1-benzopyran-4-one,4)、1(2H)-3,4-二氢-4,8二羟基萘[3,4-dihydro-4,8-dihydroxy,1(2H)-naphthalenone,5]、3,5双去氧-5-苯基戊糖酸γ内酯(3,5-dideoxy-5-phenyl-,γ-lactone,pentonic acid,6)、4-羟基苯乙醇乙酯(4-hydroxyphe-nylethyl acetate,7)、1,4-二氧-2,5-二酮-3,6-二苯甲基聚酯[3,6-bis(phenylmethyl)-1,4-dioxane-2,5-dione,8]。结论真菌Nigrospora sphaerica为首次从海洋中分离得到,化合物1-8为首次从该菌中分离得到。

红树植物内生真菌Nigrospora sphaerica的次级代谢产物研究

对红树植物木果楝来源内生真菌Nigrospora sphaerica进行了次级代谢产物研究.综合运用硅胶柱层析、重结晶、分析型和半制备型高效液相色谱等现代色谱学和化学方法对其大米发酵产物进行了分离纯化,从中分离得到了10个化合物,并根据化合物的光谱数据和理化性质鉴定了其化学结构分别为:bis-(2-ethylhexyl)-phthalate(1),邻苯二甲酸二丁酯(2),1-phenyl-1,2-ethanediol(3),tyrosol(4),单乙酸甘油酯(5),R-mevalonolactone(6),甘露醇(7),D-吡喃葡萄糖(8),亚油酸(9),3-methylbut-2-enyl-4-hydroxybenzoate(10).除化合物4外,其余化合物均为首次从该菌种中分离得到.

海洋真菌Nigrospora sphaerica中化学成分的研究

目的研究海洋真菌Nigrospora sphaerica菌丝体中的化学成分，以期得到有活性的先导化合物。方法利采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱等方法进行分离纯化，通过理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果从真菌Nigrospo—Fasphaerica的菌丝体提取物中分离并鉴定了11个化合物，分别为麦角甾-5，7，22E-三烯-3卢-醇（1），胆甾醇（2），吡咯并哌嗪．2，5-二酮[环（脯-甘）二肽]（3），3-甲基-吡咯并哌嗪-2，5-二酮[环（脯-丙）二肽]（4），3-苄基-吡咯并哌嗪-2，5-二酮[环（脯-苯丙）二肽]（5），3-苄基-哌嗪-2，5-二酮[环（甘-苯丙）二肽]（6），5-羟甲基糠醛（7），亮氨酸（8），3，6-二甲基-哌嗪-2，5-二酮[环（丙-丙）二肽]（9），腺嘌呤（10），尿嘧啶核苷（11）。结论化合物1，3～7和11为首次从海洋真菌Nigrospora sphaerica中分离得到。

黑孢霉属和沃德霉属2个新记录种

从采自湖北和四川省的土壤标本中分离到2个中国新记录种——球孢黑孢霉(Nigrospora sphaerica)和膨梗沃德霉(Wardomyces inflatus),并对二者进行了形态学描述和绘图。研究菌株的干制培养物标本与活菌种均存放在山东农业大学植物病理学标本室(HSAUP)。

甘蔗黑孢霉叶斑病病原菌分离鉴定及药剂筛选试验

【目的】明确引起甘蔗黑孢霉叶斑病的病原菌及其生物学特性,设计甘蔗黑孢霉叶斑病病原菌的检测引物,筛选能有效抑制病原菌Nigrospora sphaerica的杀菌剂,为甘蔗黑孢霉叶斑病的田间防治提供指导意见。【方法】对采自广东省广州市番禺区的发病黑皮甘蔗叶片采用组织分离法纯化培养,5 d后,光学显微镜下观察菌丝和孢子;对分离物进行致病性测定;基于ITS序列,采用MRGA7.0以最大似然法构建系统发育树并根据获得的ITS序列设计特异性检测引物Ng1F/Ng1R和Ng2F/Ng2R;采用菌丝生长速率法对7种不同杀菌剂对甘蔗黑孢霉叶斑病原菌N.sphaerica的室内抑菌效果进行筛选。【结果】通过病原菌形态和分子鉴定以及生物学特性研究,引起甘蔗黑孢霉叶斑病的病原菌为N.sphaerica,其最适培养条件为温度25℃和pH 7;Ng1F/Ng1R可用以甘蔗黑孢霉叶斑病原菌的检测;咪鲜胺药剂0.16 mg/L和施保功药剂2.4 mg/L对N.sphaerica的抑菌效果最显著,抑菌效果均可达到93%以上。【结论】引起甘蔗种传病害甘蔗黑孢霉叶斑病的病原菌为N.sphaerica,Ng1F/Ng1R可用于甘蔗黑孢霉叶斑病病原菌的检测,咪鲜胺和施保功药剂可作为甘蔗黑孢霉叶斑病的田间防治药剂或种苗脱毒处理药剂。

一株寄生柑橘介壳虫真菌的分离与鉴定

从感病柑橘介壳虫中分离和鉴定了一株菌株,为球黑孢霉菌[Nigrospora sphaerica（Sacc）Mason]。菌株在20~35℃范围内均能生长,25~30℃是菌落生长的最适温度区域。病菌在以淀粉为碳源的培养基上菌丝生长量较大,且菌丝生长丰度高。该菌对果糖、麦芽糖、乳糖、淀粉和葡萄糖为碳源的培养基的利用率均较高。该菌在以硫酸铵为氮源的培养基上菌丝生长量较大,其次是硝酸铵、甘氨酸和赖氨酸。

银杏外种皮中银杏酸对真菌的抑制作用

银杏酸是银杏外种皮中的重要功能性成分。本实验从银杏外种皮中提取银杏酸,用大孔树脂和硅胶对银杏酸进行纯化,并研究了银杏酸对真菌的抑菌活性和抑菌机理。HPLC分析结果表明银杏酸中白果酸C15:1含量最高。考察银杏酸对致病真菌球黑孢霉、链格孢霉、扩展青霉的抑制作用,结果表明其对球黑孢霉和链格孢霉的抑制作用最强,在5 mg/mL下对球黑孢霉的抑制率为65.82%。银杏酸对球黑孢霉抑菌机理可能是银杏酸可以裂解球黑孢霉细胞膜,使球黑孢霉细胞膜通透性变高,菌液电导率上升;同时造成细胞膜损伤,菌丝体蛋白质外泄,降低了球黑孢霉菌丝体中SOD、CAT酶活性,使抗性酶对球黑孢霉的保护作用变弱,呈现出银杏酸对球黑孢霉的抑制作用。

产7α,15α-双羟基去氢表雄酮的球黑孢菌紫外诱变育种及发酵条件

球黑孢菌可以在去氢表雄酮(DHEA)的C-7α和C-15α位进行双羟基化反应,生成7α,15α-双羟基去氢表雄酮(7α,15α-diOH-DHEA)。以球黑孢菌FN-A127为出发菌株进行紫外诱变,筛选出最佳菌株FN-A7,并对FN-A7进行遗传稳定性研究和发酵条件优化。结果表明,紫外诱变最佳照射时间为15min,菌株FN-A7的遗传稳定性良好。在发酵培养基中加入2g/L的DHEA,在8%的接种量、30℃进行发酵,突变菌株FN-A7将DHEA转化为7α,15α-diOH-DHEA的产率可达到31.96%。

鹅绒藤叶斑病两种致病菌的鉴定

鹅绒藤(Cynanchum chinense R.Br.)是一种很有开发价值的野生药用植物资源,其汁液具有抗肿瘤等多种功效,但其栽培中易发生叶斑病。从鹅绒藤感病叶片中单斑分离出2株真菌,P1单斑分离率为68.18%、P2为6.82%,侵染试验证明二者均具侵染性;形态学与分子生物学鉴定证明,P1为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、P2为球黑孢(Nigrospora sphaerica)。P1菌丝在15~30℃下能生长但最适为24℃、致死为63℃,最适p H为7,最适湿度为50%,菌丝适宜全黑暗下生长;蔗糖是最适碳源、尿素是最适氮源、Na H2PO4是最适无机盐、维生素B1是最适生长因子;培养2~3 d为菌丝速长期,第5天可见菌核产生,未见孢子产生。P2菌丝在5~35℃下能生长但最适为24℃、致死为68℃,最适p H为8,最适湿度为90%,菌丝生长宜黑暗条件;D-果糖为最适碳源、酵母膏为最适氮源、K2HPO4为最适无机盐、萘乙酸为最适生长因子;培养2~3 d为菌丝速长期,第4天可见孢子产生,在15~35℃能产孢但最适为24℃,孢子萌发最适温度为25℃、最适p H为8、最适湿度为90%、光照利产孢但黑暗宜孢子萌发。

一株真菌对铜离子的耐受性初步研究及鉴定

用含有不同铜离子浓度的PDA平板培养菌株XLS,通过测菌落直径检测菌株的耐铜性,对菌株进行分子生物学鉴定。结果显示:当铜离子浓度为20mg·L^(-1)时,菌落直径最大,为88.54mm,菌丝最浓密,说明在该浓度时铜离子能促进菌株XLS的生长,但效果不显著;浓度≥80mg·L^(-1)时,菌落直径呈递减趋势;铜离子浓度为80mg·L^(-1)时,菌落生长略微受到抑制;当铜离子浓度提高到200mg·L^(-1)时,菌落直径下降明显,浓度为300mg·L^(-1)时菌落直径仅为20.14mm,400mg·L^(-1)时菌株生长完全受到抑制,该菌株对铜的最大耐受浓度≤400mg·L^(-1),抗铜性较强。将该序列提交到GenBank(Accession No:KY889145),根据Blast比对结果,将其初步鉴定为Nigrospora sphaerica,即球黑孢菌。

球黑孢霉引起白色浅表型甲真菌病一例

目的报道1例球黑孢霉引起的白色浅表型甲真菌病。方法取病变趾甲作直接镜检、真菌培养和组织病理学检查，分离菌株行DNA序列分析、明胶液化试验、体外药敏试验和甲板受侵试验。结果21岁男性患者，右足拇趾甲板白色病变5个月。病变甲屑直接镜检发现孢子、菌丝和叶状分生孢子梗，组织病理显示甲板内有大量孢子及菌丝。沙氏葡萄糖琼脂培养基培养出黑色羊毛状菌落，DNA序列分析提示为黑孢霉属。菌株可液化明胶和侵犯甲组织，对制霉菌素、伊曲康唑、两性霉素B、克霉唑高度敏感。伊曲康唑冲击治疗5个疗程后，病甲恢复正常。结论根据其形态学特点和DNA序列分析，菌株被确定为球黑孢霉。球黑孢霉引起的白色浅表型甲真菌病为国内首例报道，伊曲康唑治疗有效。