应用荧光定量PCR验证干扰素诱导表达基因在系统性红斑狼疮患者中的表达

目的 应用荧光定量聚合酶链反应技术验证由基因芯片发现的干扰素 (IFN)诱导基因表达谱在系统性红斑狼疮 (SLE)、类风湿关节炎 (RA)和正常人中的表达。方法 测定 4 0例SLE患者、2 8例RA患者和2 9名正常人外周血白细胞Ly6e、IFIT1、OAS2IFNw、IFNa13表达 ,初步分析外周血分离出来的T、B及单核细胞中这些基因的表达。结果 与正常人相比 ,SLE组的Ly6e、IFIT1、OAS2基因表达显著增高 ,其中Ly6e、OAS2基因的表达较RA组也显著增高 ,但IFNw、IFNa13基因表达反而降低 .这组基因在单核细胞的表达最高。结论 IFN诱导的基因在SLE患者中呈高表达 。

Retro-Tet:一种基于逆转录病毒的诱导性基因表达系统

Retro Tet基因表达系统是一种新型的高效、稳定、无毒、具有严密开 关功能的可诱导性真核细胞基因表达系统 .该系统兼备了逆转录病毒基因表达系统和Tet off Tet on基因表达系统的优点 ,在稳定表达细胞系的筛选、基因的表达与调控及基因功能研究等方面得到了成功的应用 。

植物基因的化学诱导表达系统研究进展

激活基因表达或使基因表达失活的化学诱导系统在确定基因功能及植物生物技术中有许多潜在的应用。基因表达的精确调控是化学诱导系统的重要方面。综述了植物基因的化学诱导表达系统的种类以及最新应用,并对其发展趋势进行了展望。

可用于转基因动物的基因诱导表达系统

可诱导的基因表达系统对于研究基因的功能活动及其产物的生物学功能很有意义。它在转基因动物中的应用已经十分成功。本文介绍了最近出现的ＩＮＦ－ Ｍｘ１ 诱导表达系统、Ｔｅｔｏ 诱导表达系统、Ｅ－ ＥＣＲ 诱导表达系统和ＲＵ４８６ 诱导表达系统的基本原理及其应用情况，并对其优缺点进行了分析和评价。

鸣禽前脑听觉和鸣唱系统zenk基因的诱导表达

鸣曲和鸣唱行为可以诱导鸣禽前脑不同区域的zenk基因表达.鸣禽听到同类鸣曲时在听觉系统会出现zenk表达,并在致聋后这种诱导消失.而鸣禽鸣唱时,在鸣唱系统同样有zenk基因的表达,且不依赖于听觉反馈,因为致聋鸟只要发声就可以诱导表达.大量的研究表明,zenk基因在听区的诱导表达不仅可对同类鸣曲进行识别,而且在教习曲模板的记忆方面发挥重要作用.鸣唱系统zenk基因诱导表达则主要与鸣曲的产生与维持有关.zenk基因在两个系统中的诱导表达将听觉感知与鸣唱运动紧密联系起来.

植物基因工程中化学诱导表达系统研究近况

利用可诱导表达系统可使目的基因在特定的时间内表达 ,从而有利于我们研究其基因产物的作用。本文着重介绍了几种利用植物远缘物种的调控元件构建而成的化学诱导系统 。

小鼠H1foo基因四环素诱导表达系统的构建与表达

卵母细胞特异性连接组蛋白H1foo(Linker histone H1foo)是连接组蛋白H1(Histone 1)在卵母细胞中特异性表达的1个亚型,H1foo在卵母细胞减数分裂和成熟发育过程中起着不可替代的作用,而且H1foo也参与了重编程过程。为了在体细胞中进一步研究H1foo的功能,本试验通过采用四环素诱导表达载体系统,用PCR的方法扩增了小鼠的H1foo基因和四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子区。用双酶切和连接等方法将上述元件连接到真核表达载体pVenus上,构建了重组质粒pVenus-tet-CMV-H1foo。双酶切和测序结果显示,片段连接正确,且全长测序正确。本试验所构建的四环素诱导的小鼠H1foo真核表达系统有助于人们在体细胞中更好地探讨H1foo在特定时间的作用和功能。

可用于转基因动物的基因诱导表达系统

带有ＩｏｘＰ的β－ＤＮＡ多聚酶基因的转基因小鼠，在经ＩＦＮ或ｐｏｌｙｌ－ｐｌｙＣ的诱导处理后，ｐｏｌβ基因缺失的分析，就可以了解Ｃｒｅ－ＩｏｘＰ系统的作用效率。在Ｃｒｅ－ＩｏｘＰ转基因小鼠中，注射ｐｏｌｙｌ－ｐｌｙＣ或ＩＦＮ后的两天内，在肝细胞中的ｐ...

蓝藻热休克诱导高效表达系统的构建

以聚球藻Synechococcussp .PCC794 2作为基因工程受体菌 ,构建了热休克诱导的高效表达系统。用PCR法扩增并克隆出Synechococcussp .PCC794 2自身的热休克基因 groESL操纵子的强启动区 (2 4 0bp) ,并紧靠其后组装上泛素 (UB)融合的胸腺素α1(Tα1)目的基因 ,在下游组装有rbcSpolyA终止子。此外 ,还组装了一个完整的卡那霉素抗性基因作为筛选标记基因。这样 ,就构建了完整的蓝藻的基因表达系统。经转化蓝藻Synechococcussp .PCC794 2细胞 ,在 4 2℃热诱导 30min后 ,目的基因UB Tα1得到较高水平表达 ,表达量约占可溶性蛋白的 8.7%

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌 (IAM 110 0 1)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB ,构建具T7强启动子的pET 2 0 (b) bgaB质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 .经IPTG诱导后 ,重组菌周质中乳糖酶酶活达到 0 .12U /mL ,胞内酶活为 1.35U /mL ,比酶活为 6 .6 6U/mg蛋白 ,比酶源菌产生的酶活提高 5 0倍 .通过对IPTG诱导时机、诱导浓度和诱导时间的优化研究 ,重组菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的 90倍 .

植物中的化学诱导基因表达系统

转基因作物具有提高农业产量的巨大潜力,这种新技术已迅速应用,此类作物的种植面积已由1996年的280万公顷增至1997年的1270万公顷。转基因作物的应用对农业化学品的使用产生了重要影响。 在农业市场上的第一代生物技术产品是各种能耐受除草剂和抗虫、抗病毒的作物品种。这类作物含有一个插入的DNA单元,其由在支配着抗性基因的表达部位、时间及表达水平的启动子控制下的抗性基因组成。目前大部份转基因作物具有一个在组成型启动子控制下的抗性基因,如烟草花叶病毒的35S启动子(35SCaMV)。

食品级高效诱导表达系统—NICE系统

乳酸菌NICE系统是在乳链菌肽诱导下由nisA启动子控制目的基因表达的,含nisR和nisK的两组分调节系统的高效诱导表达系统。由于NICE系统的诱导剂、宿主菌和载体都是食品级的,其应用前景十分广阔。

Tet-on基因表达系统反应质粒P^(TRE-HIF-1α)的构建和表达鉴定

目的克隆和构建携带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α。方法以缺氧的肝癌细胞株HepG2总RNA为模板,进行RT-巢式PCR,获得HIF-1α的cDNA,克隆入Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE2hyg,酶切重组子鉴定。将构建好的PTRE-HIF-1α用脂质体法转入HepG2Tet-on细胞,在强力霉素的作用下,用RT-PCR及Westernblot法鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1α的cDNA测序结果与Genbank记载完全一致,并成功克隆入PTRE2hyg,将反应质粒PTRE-HIF-1α转入HepG2Tet-on细胞,可以完整有效表达HIF-1α且受强力霉素的调控。结论成功克隆和构建携带HIF-1α基因的Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α,并证明其表达能在HepG2Tet-on细胞中受强力霉素调控。

化学诱导表达系统及其在植物中的应用

化学诱导启动子可以在特定时间和部位激活或抑制目的基因的表达。目前,已经建立了多种化学诱导表达系统,用于基因功能分析、无标记植物转化、特定位点DNA切除、育性恢复和RNA沉默等方面的研究。化学诱导表达系统为基础分子生物学研究和生物技术应用提供了强有力的工具,将大大加快植物转基因技术的应用。

植物的化学诱导表达系统

利用植物内源性化学诱导启动子或其它生物的化学诱导响应元件都可以在植物中构建化学诱导表达系统。化学诱导表达系统可以分为去抑制、失活、激活三种 ,三种方式的原理相似 ,需要两个转录单位组成 ,第一个转录单位由一个组成型启动子 (如CaMV 35S)转录一个对化学诱导剂敏感的转录因子 ,第二个转录单位含有多个能结合转录因子的位点与一个基本植物启动子 (如截短的CaMV 35S)组成的嵌合型启动子调控目的基因的表达。构建双元调控系统可以克服单元系统的不足。文章叙述了一些已构建的化学诱导系统的特征和局限性 ,阐明了理想化学诱导表达系统的要求和理想化学诱导剂的条件。指出化学诱导系统的应用是很有前途的。

枯草杆菌诱导型高效表达-分泌系统的构建

利用枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株,sac B诱导基因及degQ,degU(Hy)正调控基因构建了诱导型表达-分泌系统以解决枯草杆菌分泌大量胞外蛋白酶和外源基因表达水平不高的问题,采用共转化方法将枯草杆菌IA95的degU(Hy)突变引入枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株DB403,获得degU(Hy)和蛋白酶三缺陷的新菌株DB1342;利用sacB基因的启动子——信号序列及芽孢杆菌的两个正调控基因degQ和degU(Hy)构建了诱导型表达-分泌载体pURT3及pURTQ4,由DB1342突变株及pURT3及pURTQ4载体组成枯草杆菌诱导型高效表达和分泌系统.在本系统中内源基因sacB的表达量是原菌株DB403的296倍,将地衣杆菌α-淀粉酶基因引入本系统后在sacB,degQ.degU的调控和蔗糖的诱导下,α-淀粉酶的表达量是在DB403中的140倍,证实degQ及degU对基因表达的增强作用是叠加的.

四环素诱导的猪黑素皮质激素受体-4基因真核表达载体的构建

猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子调控区与转录调节元件。采用双酶切和连接等方法将上述元件连接到pcD-NA3.1(+)上,构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R。经双酶切和测序鉴定,结果显示片段正向连接且片段全长测序正确。试验成功构建了四环素诱导的pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R真核表达载体,并能在时间特异性方面调控MC4R基因的表达。

不同病毒载体系统应用于水牛体细胞转基因的研究

为了筛选出能高效率感染水牛体细胞、实现基因转移的病毒表达载体系统,试验采用携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的3种不同病毒载体介导的转基因,即逆转录病毒载体(pMX-EGFP)、诱导型慢病毒载体(FUW-TETO-EGFP)和慢病毒载体(FUGW-EGFP)系统进行病毒包装,然后分别一次或二次感染不同的水牛体细胞[水牛胎儿成纤维细胞(BFFs)和水牛胃细胞(BSTC)],应用荧光显微镜观察EGFP是否表达,然后用流式细胞仪检测感染效率,最后用G418对感染效率低的病毒载体系统进行阳性细胞系筛选。结果表明:3种病毒载体系统均能感染BFFs和BSTC,实现了基因的转移和表达,FUGW-EGFP、FUW-TETO-EGFP系统对水牛体细胞的感染效率显著高于pMX-EGFP系统(P<0.05);除FUGW-EGFP系统感染BSTC外,同种类型病毒载体系统感染同种细胞,二次感染的感染效率高于一次感染,但均差异不显著(P>0.05);同一病毒载体系统一次感染BSTC的效率高于感染BFFs。说明FUGW-EGFP、FUW-TETO-EGFP系统对水牛体细胞的感染效率高于pMX-EGFP系统,而且BSTC比BFFs更易被病毒感染。

构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究

目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR片段。通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架,获得Dox诱导型sgRNA反转录病毒载体。为了验证系统有效性,分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。设计对照(non-targeting control,NC)组和实验组(靶向F4/80)的sgRNA,利用反转录病毒感染细胞,分化条件设置添加Dox组(Dox^(+))和不添加Dox组(Dox^(-))。通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验检测基因敲除效果。结果·①成功构建Dox诱导型sgRNA反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。②流式结果显示,在NC Dox^(-)组、NCDox^(+)组和F4/80 Dox^(-)组中,几乎无F4/80阴性细胞群体;而在F4/80 Dox^(+)组中,F4/80阴性细胞群体高达50%。③T7EⅠ结果显示,在F4/80 Dox^(-)组中,DNA条带完整,而在F4/80 Dox^(+)组中发生基因突变,DNA条带被切开。结论·结合Dox诱导型sgRNA表达载体和Cas9转基因小鼠,成功构建诱导型CRISPR/Cas9系统。利用该系统成功在小鼠免疫细胞中实现可诱导性基因敲除。

沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖及凋亡的影响

背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的:构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法:采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡能力的影响。结果与结论:(1)设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3),均成功连入Tet-on载体,且各组载体序列正确;通过慢病毒成功感染HEK-293T细胞;(2)实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P<0.05),且沉默组不加入强力霉素诱导后目的基因的表达得到回复;(3)集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P<0.05);Western blot检测敲低MKRN1后,增殖细胞核抗原表达下调,细胞凋亡相关指标BAX表达增加,Bcl2表达下调,Bcl2/BAX的比值下调(P<0.001);(4)结论:采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株,且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖,并促进其凋亡。通过构建稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞可为进一步研究MKRN1的生物学功能奠定基础,也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考。